肿瘤免疫细胞浸润还想发高分需要怎么分析

今天小编解读的这篇文章是2020年发表在杂志上Molecular Therapy-Nucleic Acids（IF：7.032），题目为Characterization of the Immune Cell Infiltration Landscape in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma to Aid Immunotherapy. 本文发现ICI模式的差异与肿瘤异质性和治疗复杂性有关。因此，本研究对肿瘤ICI模式的系统评价具有重要的临床意义。

摘要

肿瘤微环境（TME）主要由肿瘤细胞和基质成分混合的浸润肿瘤的免疫细胞组成。最近的一项临床试验表明，肿瘤免疫细胞浸润（ICI）与免疫疗法的敏感性以及头颈部鳞状细胞癌的预后相关。然而，迄今为止，尚未阐明HNSC的免疫浸润情况。在此，作者提出了两种计算算法来揭示1029名HNSC患者的ICI情况。定义了三种ICI模式，并使用主成分分析确定了ICI分数。高ICI评分的特征是TMB增加和免疫激活信号通路。在低ICI评分亚型中观察到转化生长因子b（TGF-b）和WNT信号通路的激活，表明T细胞受到抑制，可能与预后不良有关。两个免疫治疗队列证实，ICI评分较高的患者显示出显著的治疗优势和临床益处。这项研究表明，ICI评分可作为免疫疗法的有效预后生物标志物和预测指标。评估更大样本量的ICI模式将扩展对TME的理解，并可能为当前有关HNSC免疫治疗策略的研究提供指导。

流程图

结果简述

1. 头颈部鳞状细胞癌免疫细胞浸润的情况

首先，作者使用CIBERSORT和ESTIMATE算法来量化HNSC肿瘤组织中免疫细胞的活性或富集水平。基于1029个肿瘤样本和来自meta队列的匹配免疫细胞浸润（ICI）谱，使用R包ConsesusClusterPlus进行无监督聚类，将HNSC患者分为不同的亚型。

作者确定了三种具有明显生存差异的独立ICI亚型（如下图A和B）。为了进一步阐明导致不同临床表型的内在生物学差异，作者比较了TME的免疫细胞组成。在三种主要的免疫亚型中，ICI簇A与预后良好相关，中位生存期为2064天。它的特征是高水平B细胞，M1和M2巨噬细胞，浆细胞，记忆CD4 T细胞，CD8 T细胞和γ-δT细胞浸润。ICI簇B的中位生存时间为1762天，ICI簇B中的患者的特征是静息树突状细胞（DC），活化的自然杀伤（NK）细胞和滤泡辅助性T细胞的密度显著更高。ICI簇C中的总体生存期较短（OS；中位生存期1281天），并且激活的DC，激活的肥大细胞，嗜中性粒细胞，静息NK细胞，静息的CD4 + T细胞的浸润水平更高。此外，生成了相关系数热图以可视化TME中免疫细胞相互作用的普遍情况（下图C）。作者还分析了每个ICI亚型中的两个重要的免疫检查点，即PD1和PD-L1。ICI簇A的特征在于PD1 / PD-L1的表达水平明显较高，而ICI簇C的PD1 / PD-L1的表达水平较低。Kruskal-Wallis检验用于检测三种不同ICI亚型的免疫细胞与PD1 / PD-L1表达水平之间的显著差异（下图D-F）。

2. 识别免疫基因亚型

为了揭示不同免疫表型的潜在生物学特征，作者进行了差异分析，通过R软件的limma包确定这些亚型之间的转录组变异。在随后的分析中，主要重点是TCGA-HNSC队列，该队列具有最详尽的临床信息。作者通过先前的差异分析获得了1089个差异表达基因（DEG），该分析将TCGA队列分为三个基因组聚类，即基因簇A–C。与基因簇正相关的588个基因特征被称为ICI基因特征A，其余DEG被命名为ICI基因特征B。同时，为了减少噪声或冗余基因，作者使用了Boruta算法对ICI基因特征A和B进行了尺寸缩减。热图描绘了在整个基因组簇中识别的276个最丰富的DEG的转录组谱（下图A），下图C和D中总结了显著富集的生物学过程。通过相关分析确定ICI特征基因与PD1 / PDL1之间的相关系数，作者观察到大多数ICI特征基因与PD1 / PDL1表达水平显著相关。

此外，作者通过将ICI基因簇与生存信息相结合来探索其预后意义。通过Kaplan-Meier曲线，作者发现基因簇A的患者预后较好，而基因簇B和C的患者预后不良（如下图B）。有趣的是，作者发现基因簇A和C与明显较高的免疫评分相关。多项研究表明，免疫系统可能具有有利和不利的结果，正如分析中所观察到的，这些结果可能以促肿瘤或抗肿瘤活性的形式展现出来。

如下图E所示，基因簇C表现出间质成分浸润和免疫抑制相关的M2巨噬细胞增加，而DC浸润减少，这在先前的研究中被表征为“免疫力衰竭表型”。另外，三个基因组簇在PD1 / PD-L1表达水平上显示出显著差异（下图F和G）。ICI基因簇A和C与较高的PD1 / PD-L1表达水平相关，而ICI基因簇B与最低的PD1 / PD-L1表达水平相关。综上所述，不同基因簇的免疫谱和预后谱之间的一致性表明作者的分类方法是科学合理的。

3. ICI分数的构建

为了获得HNSC患者ICI状况的定量指标，作者使用主成分分析（PCA）计算两个总评分：（1）ICI特征基因A的ICI评分A，以及ICI特征基因B的ICI评分B。本研究中每位患者的ISA和ISB计算为个体相关个体得分的总和。最后，作者获得了定义为ICI评分的预后特征评分。通过使用X-tile软件获得的最佳临界值，将TCGA队列中的患者分为ICI得分高和低两组。患者在三个基因簇中的分布如图A所示。在确定TCGA队列和其他独立数据集中ICI评分的预后价值之前，我们分析了TCGA队列中各组的免疫活性和耐受条件。为了对此进行评估，首先，我们选择CD274，CTLA4，HAVCR2，IDO1，LAG3和PDCD1作为与免疫检查点相关的特征，并选择CD8A，CXCL10，CXCL9，GZMA，GZMB，IFNG，PRF1，TBX2和TNF作为免疫激活相关特征，高ICI组中除CD274，TBX2，HAVCR2和TNF外，大多数与免疫检查点相关和与免疫活性相关的基因均显著过表达（如下图B）。此外，基因集富集分析（GSEA）显示，低ICI评分组中WNT和TGF-b信号通路显著富集，而NK细胞介导的细胞毒性，B细胞受体和T细胞受体信号通路则富集于高ICI组，如下图C、D所示。

随后的分析涉及对ICI评分的预后影响的评估。使用Kaplan-Meier进行的ICI评分亚组分析显示，高ICI评分组的患者的OS率明显低于低ICI评分组（如下图E）。作者还评估了辅助治疗对每个ICI亚组预后的影响。作者发现，低ICI评分组的生存优势在接受辅助放疗的患者中明显（下图F和G）。

4. ICI分数与体细胞变异之间的相关性

大量证据表明，携带高TMB的肿瘤组织中CD8 + T细胞浸润水平增加，从而识别并消除了这些肿瘤。这暗示着TMB可能决定了个体对癌症免疫疗法的反应。作者试图探索TMB和ICI评分之间的内在联系，以阐明每个ICI亚组的遗传印记。

作者首先比较了高ICI和低ICI评分组的患者的TMB。如下图A所示，ICI评分较高的亚组患者的TMB显著高于ICI评分较低的亚组。进一步的相关分析证实，ICI得分与TMB显著正相关（如下图B所示）。接下来，作者根据TMB的免疫设定点将患者分为离散的亚组。如下图A所示，低TMB的患者表现出比高TMB有更好的OS。考虑到TMB和ICI评分的预后价值，作者接下来评估了这些评分在HNSC的预后分层中的协同作用。分层生存分析显示，TMB状态不会干扰基于ICI分数的预测。ICI分数亚型在高TMB和低TMB亚组中均表现出显著的生存差异（如下图D）。总的来说，这些发现表明，ICI评分可能是独立于TMB并有效测量对免疫疗法反应的潜在预测指标。此外，作者评估了低和高ICI亚组之间HNSC驱动基因中体细胞变异的分布。并进一步分析了变化频率最高的前25个驱动基因（下图E）。通过对TCGA队列的突变注释文件进行分析，发现TP53，NSD1，CSMD3，SYNE1，PKHD1L1，USH2A，PIK3CA，CASP8，FLG，PCLO，AHNAK，COL11A1和RYR2的突变频率之间存在显著差异。这些结果可能为研究免疫检查点中肿瘤ICI组成和基因突变的机制提供新思路。

5. ICI评分在免疫治疗益处预测中的作用

新兴的免疫检查点阻断疗法已用于癌症治疗，以阻断癌症治疗中的T细胞抑制分子。在随后的分析中，作者检查了ICI评分在推测患者治疗获益中的效用。为此，在IMvigor210队列中接受抗PD-L1免疫治疗的患者被分配为高或低ICI评分。值得注意的是，ICI得分高的患者明显比低ICI的患者寿命长，如下图A所示。高ICI评分组的抗PD-L1治疗的客观反应率高于IMvigor210队列中的低ICI组（下图B）。作者还发现，IMvigor210队列中较高的ICI分数与对抗PD-L1治疗的客观反应相关，如下图C所示。在TCGA-SKCM队列中观察到了相似的结果，该队列接受了不同的免疫疗法，例如细胞因子，疫苗和检查点阻断剂（如下图D-F）。总体而言，这些数据表明ICI评分可能与对免疫疗法的反应相关。