说到单细胞RNA测序技术，想必大家也都不陌生吧。它在肿瘤细胞异质性，细胞转录图谱，干细胞发育及分化，免疫细胞研究及神经系统发育都有独特的作用。成为当下最火热的研究技术之一。从国自然项目中可以看到，2019年有101个单细胞测序项目，相比于2018年单细胞测序项目79项，增加了32项。所以单细胞测序技今天小编给大家带来的是一篇发表在影响因子在6.5分的Cancer Letter的文章。作者利用单细胞测序技术解析了结直肠癌肝转移中的肿瘤免疫微环境的变化。
在这项研究中，单细胞RNA测序从转移瘤和正常组织中鉴定出12个细胞簇(簇0–11)。利用标记基因将2和11簇细胞被分为癌细胞，来自集群0、1和7的细胞被分为T细胞群，5和9簇细胞被分类为内皮细胞，骨髓细胞由簇3、4和6组成，聚类8和聚类10分别被确定为成纤维细胞和B细胞。在肿瘤样本中，癌细胞、T细胞和粒细胞是最丰富的细胞群。正常样本中，T细胞、内皮细胞和巨噬细胞占细胞总数的大多数。
细胞群鉴定后，在12个细胞群中获得445个CCDGs，并且表达聚类识别出6个模块，对应于6种细胞类型。分析了6个模块的生物学过程，癌细胞中第2和第11簇主要为细胞间粘附。0、1和7簇是T细胞群参与免疫反应。内皮细胞中5和9簇，参与血管生成，B细胞受体信号通路被显著识别。髓细胞最重要的生物学过程是炎症反应和趋化因子配体。作者使用STRING数据库解释了78个功能注释CCDGs的蛋白质-蛋白质相互作用找出了相关节点且大多数基因位于细胞外，尤其是趋化因子配体，表明它们在结直肠癌肝转移中微环境成分的信号转导中的重要作用。
在癌细胞群中，作者进行了进一步的信号途径分析，第2组和第11组中的前10个生物过程和信号途径除了癌细胞行为之外，还有与代谢相关项目、免疫调节相关以及对缺氧的反应显著丰富，表明肿瘤微环境组成的复杂性。
癌症样本中的T细胞比例明显低于正常样本。肿瘤浸润性T细胞亚群是微环境中起免疫监视和肿瘤免疫治疗作用的关键免疫因子。基于标记基因，作者进一步研究了CD8+t的细胞，CD4+T细胞，Th1/2细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+细胞毒性T细胞、效应性T细胞和记忆性T细胞。结果表明在癌症样本中，CD8+t细胞、Th1/2细胞和记忆t细胞的比例较低，而cd4+ t细胞和Tregs的比例较高。这些数据表明肿瘤免疫微环境发生变化，不利于免疫反应。对第0、1和7个细胞群中CCDGs的功能分析表明，诸如T细胞增殖、凋亡过程、细胞周期调节、T细胞共刺激、活化/分化和T细胞受体信号传导等项目被显著识别。
比较12个聚类中的CCDs的表达，共有93个CCDs在某些聚类中表现出特异性和独特的上调，并命名为CCSDG。用TCGA结直肠癌(COAD和READ)和肝细胞癌(LIHC)样品进一步评估了肿瘤样品、正常样品和肿瘤浸润性免疫细胞中CCSDGs的表达水平以及这种表达的预后意义。与正常样本相比，总共25个CCSDGs在所有三种类型的肿瘤样本中显示出显著的异常。FABP4、SPP1、GPNMB、SPARCL1、RBP7和MGP显示出高患者总生存率和无病生存率。
此外，还使用GSE81558数据集验证了FABP4、SPP1,GPNMB,SPARCL1,RBP7和MGP在非肿瘤性结肠直肠组织、结直肠癌原发样品和肝转移样品中。FABP4和SPARCL1在转移样品中显示显著降低的表达，而SPP1在转移和肿瘤样品中显示显著更高的表达。
然后是来自人类蛋白质图谱数据库分别用于验证结肠和肝脏正常样品和癌症样品中的蛋白质表达。FABP4,SPP1和RBP7与正常组织相比，在癌症样品中显示出显著的染色强度。作者进一步研究这些基因在肿瘤浸润性免疫细胞中的表达，GPNMB，SPARCL1,MGP和SPP1在肿瘤浸润性免疫细胞中显示最高纯度校正的部分Spearman相关性和统计学意义。
铁死亡介导的粒细胞死亡在结直肠癌转移中的作用
在上述6个基因中显示出在结直肠癌患者SPP1和GPNMB在第3组中特意性表达(a)。在TCGA结肠腺癌数据集中，SPP1表达与肿瘤浸润中性粒细胞、小叶树突状细胞显著相关。与spp1相比，gpnmb与肿瘤浸润性免疫细胞数据集中的b细胞和cd8+ t细胞以及coad、read和lihc样本中的中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的表达相关性更为普遍。在我们的研究中，聚类3被鉴定为粒细胞，并在肿瘤样本中显示出较高的百分比，IHC染色中性粒细胞标记物CD66b也证实。有趣的是，在我们对结直肠癌肝转移的研究中，il-17信号通路中的mmp9、cxcl8、s100a9、s100a8和lcn2在粒细胞中显著富集，表明il-17信号通路在其中的潜在作用。
Wnt通路是结直肠癌中最相关的通路之一，其异常激活与细胞增殖、侵袭行为和细胞耐药性有关。作者分析了Wnt通路分子在癌细胞、T细胞、内皮细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞和B细胞中基因表达的变化。Wnt信号通路中约81.94% 的基因上调。transwell迁移试验验证Wnt信号通路在粒细胞迁移中的作用。用β-连环蛋白抑制剂治疗PBMC衍生粒细胞后，粒细胞迁移显著减少。结果提示Wnt信号通路激活可能通过募集粒细胞和促进肿瘤浸润在结直肠癌肝转移中发挥重要作用。
