对于生信小白来说，如果无需代码和编程，通过各种在线数据库点点鼠标就能得到有意义的数据，然后把科学故事按逻辑讲述出来，可以说不仅增加对科研的兴趣和信心，也对后续研究提供指导和参考。今天和大家一起学习2020年9月发表于International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease（影响因子：2.772）的纯生信文章Construction of Potential miRNA-mRNA Regulatory Network in COPD Plasma by Bioinformatics Analysis。文章主要探索慢性阻塞性肺疾病血浆miRNA–mRNA调控网络及功能分析，涉及的数据库主要包括GEO、FunRich、miRNet、DAVID和STRING。
慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）以持续的呼吸症状、进行性气流受限和缺乏有效治疗为特征，是全世界发病率和死亡率的主要原因之一。越来越多的证据表明microRNAs (miRNAs) 异常表达参与了COPD的发病机制。然而，目前仍缺乏对COPD血浆中miRNA–mRNA调控网络的综合探索。
研究设计的流程图如图1所示：
miRNA数据集检索
作者首先以“COPD” (study keywords), “noncoding RNA profiles by array”(study type), “Home sapiens” (organism), “plasma”(attribute name)检索GEO数据库，筛选与COPD血浆相关的miRNA数据集，最后选择三个数据集（GSE24709、GSE6174117和GSE31568）用于后续分析，数据集的详细信息如表1所示。
DEMs筛选
然后使用GEO2R在线工具筛选三个数据集COPD患者和正常人群血浆之间的差异表达miRNA（differentially expressed miRNAs，DEMs），调整后的P值< 0.05和|Log(FC)|>1.5作为识别DEMs的阈值，文氏图用于选取交集，热图采用TBtools绘制。在GSE24709数据集中鉴定了148个DEMs (78个上调，70个下调)；在GSE61741中鉴定了26个DEMs (19个上调，7个下调)；在GSE31568中鉴定了71个DEMs (18个上调，53个下调)。取交集后发现六个上调(miR-1246、miR-1258、miR-556-3p、miR-1468-5p、miR-126-5p和miR- 130b-5p)，三个下调(miR-182-3p、miR-497-5p和miR-492)。
上游转录因子预测
采用FunRich预测DEMs的潜在上游转录因子，结果发现，对于上调的DEMs，转录因子是YY1和E2F1；对于下调的DEMs，转录因子是SP1、YY1、表皮生长因子受体1、E2F1、ZFP161、ELF1、SP4和MYC。
下游靶基因预测
采用miRNet预测DEMs的下游靶基因，结果共筛选出1139个靶基因，包括上调的DEMs靶基因596个和下调的DEMs靶基因 543个。
GO和KEGG通路富集分析
接下来使用DAVID进行靶基因的GO注释和KEGG通路富集分析。生物过程（BP）分析表明，DEM靶基因富集于肌肉组织发育、横纹肌组织发育和蛋白激酶活性激活等；细胞成分（CC）分析表明，靶基因主要富集于核斑点、转移酶复合物、转移含磷基团和蛋白激酶复合物中；分子功能（MF）分析表明，靶基因显著富集于DNA结合转录激活因子活性、RNA聚合酶II特异性、细胞粘附分子结合和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性方面。KEGG分析显示DEM靶基因显著富集于PI3K-Akt信号通路、人乳头瘤病毒感染、局灶粘连、乳腺癌、人T细胞白血病病毒1型感染和细胞衰老。
PPI构建和核心基因鉴定
然后利用STRING数据库构建PPI，Cytoscape软件进行可视化，CytoHubba插件鉴定核心基因。对于上调的DEMs，前10位的核心基因分别是MYC、VEGFA、MAPK8、STAT5A、FOXO3、FOXO1、IGF1、NR3C1、HSPA8、EP300；对于下调的DEMs，前10个中心基因是FBXW7、CUL3、BTRC、ZTBB 16、NAPANC 13、CDC34、FBXL18、FBXL20、SMURF1和UBE2V1(表3)。上调的DEMs与核心基因的相互作用如下:miR- 130b-5p与5个核心基因相互作用，包括EP300、HSPA8、STAT5A、IGF1和FOXO1；miR-126-5p与MYC、MAPK8、VEGFA、NR3C1和FOXO3等5个核心基因相互作用；下调的DEMs与核心基因的相互作用如下:miR- 497-5p与8个核心基因相互作用，包括SMURF1、BTRC、ZTBB 16、FBXL20、CUL3、UBE2V1、FBXL18和ANPAC 13；miR-182-3p与FBXW7相互作用；miR- 492与CDC34相互作用(图8)。
GSE56768数据集验证核心基因表达
根据DEM-核心基因网络，使用GSE56768数据集鉴定前12个核心基因（MYC、VEGFA、MAPK8、STAT5A、FOXO3、FOXO1、FBXW7、CUL3、BTRC、ZBTB16、ANAPC13和CDC34）的血浆水平。对于上调的DEMs，与正常血浆相比，COPD血浆中只有MYC和FOXO1的表达降低，而VEGFA的表达反而增加（图9A-F）。对于下调的DEMs，没有显著变化（图9G-L）。因此，miR-126-5p-MYC和miR-130b-5p-FOXO1被确定为COPD血浆中两种潜在的调节途径。
本研究基于GEO数据库和生物信息学分析，首次构建了COPD血浆中miRNA–mRNA调控网络，尤其是miR-126-5p-MYC、miR-130b-5p-FOXO1两条通路，为COPD的发病机制和治疗提供了新的思路，达到改善COPD患者预后的目的。
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