文献详解:如何让细胞亚群分析结合TIDE

刘小乐及其团队在免疫领域开发了三大科研利器:TIMER算法(精准确定肿瘤组织内免疫细胞浸润度)、TRUST算法(精准鉴定肿瘤组织中的免疫组库)和TIDE算法(有效地预测病人对免疫检查点抑制剂的疗效)。其中TIDE(Tumor Immune Dysfunction and Exclusion )反映了肿瘤如何抑制细胞毒性T淋巴细胞的功能与浸润来实现免疫逃逸,那么今天和大家介绍一下TIDE的设计理念以及如何借鉴TIDE让你的细胞亚群分析锦上添花。

一、TIDE设计理念

思想来源最近的研究揭示肿瘤存在两种不同的免疫逃逸机制,第一种为肿瘤尽管具有高水平的细胞毒性T细胞的浸润,但是这些T细胞处于功能失活的状态;第二种为一些免疫抑制因素阻止T细胞浸润到肿瘤

方法设计:首先评估患者的CTL水平(cytotoxic T lymphocytes;基于先验知识,使用CD8T细胞的细胞类型marker  CD8A、CD8B与细胞毒性功能marker  GZMA、GZMB、PRF1的平均表达水平对其进行评估),如果肿瘤具有较高的CTL水平,那么肿瘤可能通过抑制CTL的活性实现免疫逃逸,反之若是肿瘤具有较低的CTL水平,肿瘤则是通过阻止CTL的浸润实现免疫逃逸。借助T细胞失活signature与T细胞排斥signature(合称为TIDE signature)分别对具有高低CTL水平的肿瘤进行免疫逃逸能力的打分,也即TIDE得分。(图1)

 

图1 TIDE设计框架

1、T细胞失活signature

首先以一个例子进行引入:大量的研究发现CTL的水平与患者较好的预后相关,但是发现在TGFB1表达水平低的患者中,高CTL水平才指示更好的预后,而在TGFB1表达水平高的患者中却没有观察到上述的现象,这与TGFB1促进免疫逃逸和免疫治疗耐受的功能相一致。基于上述观察到的结果,对于任意一个基因,其影响CTL 的程度会反映在CTL对患者临床预后的预测中,也即该基因的表达水平与CTL 水平的交互效应可能对生存产生影响,而这种交互效应可以采用COX回归中的乘法项对其进行定量。

 

图2 T细胞失活signature 的设计思想

V代表一个基因的表达水平,乘法项的系数d表示CTL与该基因相互作用的程度,若是d>0,CTL的风险比升高,反映该基因的表达促进CTL功能的失活,使得CTL与更好生存的关联程度降低(斜率减小),反之d<0 ,则表明其增强了CTL的功能。将COX回归中Wald test z score(系数d除以其标准差)作为该基因的T细胞失活得分。对于所有的基因,都计算其T细胞失活得分,获得基因组范围内的 T细胞失活signature(注意该signature可不是常规的基因集,而是所有基因的T细胞失活得分)。

2、T细胞排斥signature

作者重点关注到限制肿瘤免疫浸润的三种细胞类型,分别为癌症相关的成纤维细胞(CAF)、髓系介导的抑制性细胞(MDSC)以及肿瘤相关巨噬细胞中的M2亚型。借助GEO数据库中这些细胞类型的表达谱,基于GEO2R的方法获得按照重要性排序的基因列表,作为基因组范围的T细胞排斥signature(这里的signature指的是所有基因其在相应细胞类型中的重要性)。

【逃脱惯性思维】常规的方法是识别与CTL水平或者浸润程度显著相关的基因作为相应的signature

3、TIDE得分

计算样本群体中每一个样本的CTL的水平,按照中位数将患者分为CTL高低两组。在CTL高的患者中,每一个患者的表达谱与T细胞失活signature的皮尔森相关性作为患者的TIDE得分;在CTL的患者中,则将每一个患者的表达谱与T细胞排斥signature的皮尔森相关性作为患者的TIDE得分。 

TIDE设计理念所受到的启发:

1) 从生物学或者临床现象出发,有时候比基于数据驱动设计方法更加合理与高效。

2) 现在大多数的研究关注局部而忽略全局,比如都致力于识别特异的或者特征基因,很少使用全部的基因信息去反映一个现象,而完成这个所缺的可能只是一个合适的方法。

3) 抽象化你学过的方法,才能活学活用,比如两个变量的互作会对另一个变量产生影响,这种互作效应可以采用回归的乘法项分析来进行量化。

二、TIDE在细胞亚型分析中的应用

你以为TIDE只能用来预测免疫治疗的应答吗(答案当然不是),给大家分享一篇文章如何借鉴TIDE让你的细胞亚型分析锦上添花。基质细胞几乎调控癌症的各个阶段,作者旨在通过探究三阴性乳腺癌中基质细胞的多样性,有助于基质治疗策略的开发。

1、三阴性乳腺癌患者的细胞组成

五个患者总共囊括了24271个细胞,基于细胞类型注释分析,发现在每个患者中都能检测到所有注释的细胞类型,但不同患者间细胞类型的比例不同,表明在该套数据集中没有患者特异的的细胞亚群。

图3 三阴性乳腺癌患者细胞组成

2、基质细胞的重新聚类揭示四种不同的细胞亚群

作者重点关注基质细胞,发现其尽管共享很多癌症成纤维细胞的marker,但是重新聚类观察到了异质性。基质细胞呈现两大cluster,分别为癌症相关的成纤维细胞(CAF)以及血液周样细胞(PVL),其中CAF进一步划分为成肌纤维细胞样- CAF (myCAFs)、炎性-CAF(iCAF)两种状态,血液周样细胞呈现出分化-PVL(d-PVL)与未成熟-PVL(im-PVL);基于这四个基质细胞亚群差异基因的功能富集分析来确定导致基质异质性的通路水平差异,揭示myCAFs富集胶原生物合成和细胞外基质调控途径,而 iCAFs富集的发育信号以及趋化调控通路;在PVL细胞中,dPVL与肌肉系统及收缩性功能相关,imPVL与基底粘连功能相关。轨迹分析揭示这四个细胞亚群是细胞分化相关的四种状态,来源于两种主要的CAF与PVL谱系,而不是完全不同的细胞亚群。

图4 基质细胞的四种亚群及其相应的功能

3、炎性-CAF与细胞毒性T淋巴细胞的功能失活相关

那么基质细胞对免疫逃逸会产生什么影响?作者接下来在三套大型独立的三阴性乳腺癌的bulk数据集中探究基质细胞基因signature( 各个基质细胞亚群的差异表达基因)与免疫逃逸的关联。借鉴TIDE的设计思想,对于基质细胞signature中的每一个基因,基于其与CTL水平对患者生存的互作效应,获得其 T细胞功能失活得分。结果显示iCAF signature更倾向于富集与CTL 功能失活相关的基因,并将这些与CTL 失活相关的基因作为 iCAF -T细胞失活signature(图5 A)。确实发现在 iCF -T细胞失活signature表达水平低的患者中,高水平的CTL预示着更好的生存,而在iCF -T细胞失活signature表达水平高的患者中确没有上述现象(图5 B)。

4、分化-PVL与细胞毒性T淋巴细胞的排斥相关

作者进一步探究基质细胞状态是否与CTL的排斥相关,首先作者定义了基质细胞类型signature,在这个section中其表示的是对于任意一个基因,计算所有基质细胞该基因的平均表达值除以该套单细胞数据集中所有细胞该基因的平均表达的比值(反映其在基质细胞中的特异性或者重要性),从而获得基质细胞 signature(表达比值),然后在三阴性乳腺癌患者的bulk表达谱,计算患者表达谱与基质细胞signature的相关性,也即获得患者的基质细胞signature得分,发现其与CTL水平呈反比,而作为阳性对照,CD4T细胞与CD8T细胞 signature得分与CTL水平成正比(图5 D)。进一步解析究竟是哪种基质细胞亚群决定了上述的效应,作者分别计算了myCAFs, iCAFs,dPVL 以及imPVL signature,发现只有dPVL 细胞亚群计算的结果与患者的CTL水平呈显著负相关,表明是dPVL 细胞亚群与 细胞毒性T淋巴细胞的排斥相关(图5 E)。作者进一步探索单细胞数据集的五个患者中是否也存在这种关联,发现P3患者具有最高的CTL浸润,其细胞组成中只有4%的dPVL细胞,而具有最低CTL浸润的P4、P5患者,却具有大比例的dPVL细胞(分别为35.5%、26.8%),进一步支持了dPVL细胞能够驱动T细胞的排斥(图5 FGH)。

图5 基质细胞亚群与免疫逃逸的关联

此篇文章其实从多方面比较综合地去刻画基质细胞亚群的异质性,包括转录调控网络、细胞形态、空间分布、调控细胞外基质的功能特性、基质-免疫细胞交互,也有很多值得大家借鉴的地方(感兴趣的小伙伴可以去详读哦~)。

参考文献:

[1] Signatures of T cell dysfunction and exclusion predict cancer immunotherapy response. Nat Med. 2018 Oct.(IF:36.13)

[2] Stromal cell diversity associated with immune evasion in human triple-negative breast cancer.EMBO J. 2020 Oct.(IF:9.889)

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