文献详解 单细胞测序数据

最近单细胞测序非常火爆,CNS文章中都有它的身影,随着单细胞测序费用的逐步降低,许多人都手握宝贵的单细胞测序数据。我们不妨和大佬学习如何玩转这些数据,为自己的研究增加闪光点。
下面跟大家分享这篇2021年1月发表在Science的一篇文章“QRICH1 dictates the outcome of ER stress through transcriptional control of proteostasis”。

一、背景介绍
1、内质网应激内质网是蛋白质分泌和折叠修饰的主要场所,当遇到不良环境刺激,如营养缺乏,感染,毒素或大量突变蛋白质等。内质网应激发生后,细胞激活了一系列信号传导途径,统称为未折叠蛋白反应(UPR)内质网UPR主要有三条通路:IRE1通路,ATF6通路,PERK通路
2、肠道免疫系统:固有免疫系统、适应性免疫系统和黏膜免疫系统。前两者由肠道的相关淋巴组织和细胞、免疫分子组成。黏膜免疫系统主要由肠上皮细胞、杯状细胞、固有层淋巴细胞、肠上皮内淋巴细胞、派伊尔结等组织构成。
二、结果解析
1单细胞测序提示终末内质网应激的特征基因
首先,作者在肠粘膜类器官中利用Tunicamycin(Tm,内质网应激诱导剂)建立不同阶段内质网应激模型, WB和qPCR验证内质网应激下游标志物Hspa5和Xbp1s。由此将UPR分为三个阶段:急性阶段(Acute);适应阶段(Adaptive);终末阶段(Terminal)。
后续单细胞测序分析发现肠上皮细胞(enterocyte)和杯状细胞(goblet cell)经过Tm处理后,发生内质网应激后的未折叠蛋白反应(UPR),而且两者之间存在显著差异。数据提示与肠上皮细胞相比,杯状细胞对内质网应激更加耐受,终末阶段UPR基因表达和细胞活力呈负相关。
图1 B-G 单细胞测序揭示特征基因及UPR三个阶段
2CRISPR筛选法寻找功能基因和未知的调控因子
作者为了寻找不同内质网应激阶段关键的调节基因,构建了全基因GRISPR筛选体系和XBP1s-GFP系统:细胞在内质网应激条件下转录表达XBP1s,会表达相应量的绿色荧光蛋白(GFP),荧光强度代表内质网应激反应的强弱。火山图、通路交互网络、韦恩图提示Tm诱导的内质网应激和终末内质网应激之间的基因有交集敲除部分UPR相关基因(如QRIHC1)可以逆转细胞在长时间内质网应激后发生的凋亡。
图2 构建CRISPR筛选体系筛选目的基因
3QRICH1促进细胞死亡且在内质网应状态下被PERK-eIF2a上调
接着作者对筛出的分子作进一步研究:QRICH1是激酶激活(caspase activation)蛋白家族中的一员,与凋亡和验证的调控有关,也参与NF-kB信号通路。作者首先用CRISPR Activation 激活QRICH1的表达,发现UPR通路激活,细胞凋亡增加。
后续,作者将QRICH1上游uORF1转录抑制序列突变后,发现QRICH1的转录抑制区域失活,导致转录活性增加,同时作者用免疫荧光实验进行证明QRICH1蛋白的核定位,证明QRICH1的上游调控与核内uORF1相关。
 
4QRICHQ 染色质共沉淀测序提示其为促进蛋白转录活性的启动子
既然共定位发现在核内,所以作者进行了RNA-seq和CHIP-seq测序。将野生型细胞和QRICH1敲除细胞进行比较,通过差异分析、通路富集分析发现QRICH1敲除细胞中“信号识别颗粒SRP”通路相关基因表达降低,敲除SRP通路相关基因(如TRAM1,RPS7)后增加了细胞在内质网应激下的活力,提示QRICH1参与新生肽链的合成同时影响细胞的活性。
图4 免疫共沉淀测序提示QRICH1调控蛋白转录活性
图5 QRICH1上调内质网应激过程的蛋白合成分泌
6.临床样本验证QRICH1在炎症病理组织中的表达
作者使用免疫印迹、流式分选实验证明了小鼠肠道类器官中杯状细胞和肠上皮细胞的差异,又利用患者组织的单细胞测序基因富集评分以及免疫荧光实验证明QRICH1在病理条件下(如小肠炎症、溃疡、肝硬化组织)的表达增加,进一步验证了QRICH1在炎性条件下响应内质网应激的调控能力。
 
三、文章亮点总结
这篇文章干湿结合,单细胞测序数据的分析使用了常见的降维方法,主要是差异分析和聚类分析,之后结合细胞实验,做了清晰的knock-in和knock-out实验进行验证,创新性地提出了内质网应激调控的关键点——QRICH1,填补了这个领域的研究空白。最后还在患者的组织切片中进行了验证,形成了完整的基础-临床证据链。此外,还结合近期较热门的元素:内质网应激、类器官、肠道免疫调节。综合起来,发表在Science也是实至名归。
小伙伴们,这篇文章对你们的单测数据研究有哪些启发呢?欢迎留言讨论。
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