膀胱癌，尤其是肌肉浸润性膀胱尿路上皮癌的治疗至今仍是一个难题。包括PD1/PD-L1在内的抗免疫检查点疗法仅使近30%的晚期疾病患者受益。新的靶点或联合治疗策略的研究有重要的临床治疗指导意义。
作者通过对8个膀胱癌肿瘤样本和3个癌旁样本的单细胞RNA测序，并结合公共数据库中的3000多个膀胱癌样本的数据集，揭示膀胱癌肿瘤微环境的高度异质性，并且证实了炎性癌症相关成纤维细胞(iCAF)在肿瘤进展中的作用。 此外，作者通过构建iCAF的调控网络，进而阐明iCAFs的促肿瘤机制。
1. 单细胞测序数据鉴定细胞类型
通过tSNE降维聚类和已知的细胞类型marker，对质控后获得的52,721个单细胞进行细胞类型鉴定，共鉴定出8个细胞类群，分别是上皮细胞；内皮细胞；两种类型的成纤维细胞iCAFs、mCAFs；B细胞；髓系细胞；T细胞；以及肥大细胞。
接下来作者对上皮细胞(EpCAM+)进一步聚类分型，发现由于拷贝数变异(CNV)，肿瘤患者的上皮细胞表现出特异的表达模式。基于CNV分析，作者将上皮细胞分为4组：正常对照组、低CNV组、高CNV组、和未检测到CNV组。
表达差异分析发现一系列基因在对照组和未检测到CNV组中特别表达，但在肿瘤细胞（高CNV组）几乎不表达。GO富集分析表明，这些基因在免疫相关途径中富集（特别是B细胞相关途径。免疫荧光实验发现，与正常上皮细胞相比，癌细胞几乎丧失了产生免疫球蛋白的能力，并且它们表达的MHC-II分子水平较低。这些结果说明膀胱癌细胞可能为逃避免疫检测而下调免疫原性。用基因集变异分析(GSVA)发现，CNV高值组E2F靶、MYC靶和G2M检查点通路丰富，而炎症和其他免疫相关通路下调。这些结果进一步证实了膀胱癌晚期的癌细胞免疫原性降低，并表现出较高的增殖能力。
2. 髓系细胞再聚类分型
髓系细胞再聚集鉴定出7种细胞亚型：肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)；单核细胞；增殖的髓样细胞；滤泡B细胞；CD1C+树突状细胞；交叉呈递树突状细胞；LAMP3+树突状细胞。
单核细胞大多来自正常粘膜组织，而肿瘤相关巨噬细胞则富集在癌组织中。而且，这两种细胞类型的转录本显示出持续的变化，表明招募到肿瘤区域的单核细胞被重新编程为肿瘤相关巨噬细胞。之后，作者利用轨迹分析和RNA速度分析进一步证实了这一现象。该结果为抑制或逆转免疫抑制微环境的形成提供了潜在的靶点。
在3个DC亚群中，LAMP3+ DCs主要富集在肿瘤样本中，而且LAMP3+DC高表达各种编码细胞因子的基因（CCL17、CCL19和CCL22）。已有研究表明CCL17和CCL22通过与Tregs膜上的CCR4，对Tregs有很强的趋化作用。因此作者推断LAMP3+DC亚群可直接或通过将Tregs募集到肿瘤区域来抑制CD8+T细胞。
3. 成纤维细胞亚型鉴定
成纤维细胞被分为两类：炎性癌症相关成纤维细胞（iCAF）和肌癌相关成纤维细胞（mCAF）。为了研究各亚群的功能，作者对iCAFs和mCAFs表达差异基因进行了GO富集分析。结果显示iCAFs与细胞外基质组织、细胞迁移调节和血管生成有关，而肌肉系统过程、局部粘连和细胞外基质相关通路在mCAF中显著富集。GSEA同样显示iCAF与细胞外基质的降解有关，表明iCAF在肿瘤转移中有潜在作用。此外，细胞因子-细胞因子受体相互作用途径也在iCAFs中富集，因此，作者研究了细胞因子在膀胱癌肿瘤组织中的表达水平。结果发现ICAF是CXCL12的主要来源，在TCGA BLCA数据生存分析发现，高表达的CXCL12与患者预后不良显著相关。
作者又通过SCENIC分析，进一步研究两种CAF亚群的功能。结果发现MEF2D和MEF2C是mCAF特异的基序，在肌肉线条的转录调控中具有深远的作用。而TCF21和TWIST2基序在iCAF中高度激活，TCF21与冠心病有关，能够增强平滑肌细胞的“纤维肌细胞”表型。
接下来，作者通过体外细胞实验、TCGA数据库数据挖掘、细胞-细胞相互作用网络构建的分析方法，深入探讨了肿瘤转移密切相关的iCAFs的在肿瘤发展过程中的作用机制。（划重点：以下内容就是能够发表10+高分文章的秘诀了！！！）
（1）体外细胞实验验证iCAFs促进膀胱癌肿瘤细胞增殖
通过GO富集分析发现iCAFs具有生长因子活性，是各种生长因子的主要来源。IGF1是一种iCAF特有的生长因子，而IGF1与总体存活率较低有关。因此作者推断iCAF促进肿瘤细胞增殖。为验证这一结论，作者用流式细胞仪对iCAFs进行分选，并将其与膀胱尿路上皮癌细胞株进行体外共培养。结果表明共培养组显示出更高的增殖能力，这证实了iCAFs在膀胱癌中的促肿瘤作用。
（2）将scRNA-seq与公共数据集相关联
作者通过TCGA BLCA数据集研究了不同细胞类型的临床作用，发现只有iCAF和mCAF的积累与较差的总体存活率(OS)有关，表明CAF与膀胱癌的肿瘤进展密切相关。而且，进一步研究发现在来自TCGA的数据中，iCAF特异性标记物PDGFRA与膀胱癌患者不良的OS显著相关，而mCAF标记物RGS5则不相关，这表明iCAF可能比mCAF有更重要的促肿瘤作用。
（3）构建基于iCAF调控的细胞-细胞互作网络
作者利用CellphoneDB2分析工具，鉴定了不同细胞类型之间的细胞-细胞相互作用网络。结果发现，iCAF与其他细胞类型的相互作用最多，而且它们与内皮细胞的相互作用特别强。iCAFs分泌的CCL2和CXCL1能与内皮细胞表面高表达的ACKR1相互作用。iCAF产生VEGF，它们与内皮细胞上的VEGF受体结合，促进血管生成。此外，FGFR1在iCAFs和内皮细胞上表达，而FGFR3在肿瘤细胞上表达。这些受体可与成纤维细胞生长因子结合，具有促增殖作用。值得注意的是，高级别肿瘤细胞高表达IGF2，与iCAF上的IGF2R相互作用，促进肿瘤进展。总之，iCAFs可以促进肿瘤细胞和基质细胞的增殖，而且由于CAF是已证实的促肿瘤生长因子的来源，靶向CAF可能是膀胱癌治疗的最佳选择。
本篇文章属于经典的单细胞测序在肿瘤研究中的应用的生信文章。作者首先通过标记基因对肿瘤组织中的细胞进行聚类分型，鉴定出8个细胞类群。然后通过细胞类群的功能注释对肿瘤相关的细胞类型进一步亚型分类，筛选出与肿瘤发生发展最相关的一类细胞群体（炎性癌症相关成纤维细胞iCAF），通过多种分析方法（体外细胞实验、TCGA数据库数据挖掘、细胞-细胞相互作用网络构建），生信分析结合简单的细胞实验，逐步挖掘验证关键细胞亚型对肿瘤影响的分子机制。本篇文章的研究思路，分析方法，你学会了吗？
