文献精读 “永生细胞”或可促进癌症复发

今天笔者带来的是今年8月发表在Nature上的关于循环持久性细胞(Cycling cancer persister cells)的文章,作者发现这些细胞不仅暴露于癌症药物时能够存活,甚至能够继续增殖,并指出循环持久性细胞不是基因突变机制产生的。另外,作者还发现循环持久性细胞会引起代谢改变。因此,循环持久性细胞对于癌症耐药复发的研究具有重要意义。

一、持久性细胞的概况

持久性细胞,定义为在药物治疗第 14 天时存活的细胞。作者利用osimertinib体外处理了PC9细胞(人肺癌细胞),之后利用活细胞成像技术来定量细胞分裂事件的数目和时间(Figure 1a)。实验发现只有 8% 的细胞谱系产生了持久性细胞,并且持久性细胞的分裂谱具有广泛的异质性(Figure 1b);而所有未处理的亲本细胞都经历了细胞分裂(Figure 1c)。与先前关于colony形成持久性细胞很少的报道一致,初始细胞群中只有不到 0.5%(持久性细胞群为13%)产生了超过 6 个细胞的持久性colonyFigure 1d)。

Figure 1

二、Watermelon系统用于追踪细胞发育

作者构建了Watermelon系统,它能够实现对癌细胞的发育进行追踪(Figure 1e)。Figure 1f展示了增殖的(白色箭头)和非增殖的持久性细胞。对这些持久性细胞在无药物处理的环境中培养20代之后,无论增殖的还是非增殖持久性细胞重新获得对药物的敏感性(Figure 1g),这表明在持续药物治疗下的增殖能力是可逆的,而不是基因突变机制。此外,来自循环持久性和非循环持久性亚群的细胞具有相似的群体倍增时间,表明药物观察到的表型差异不是由于预先存在的增殖异质性(Figure 1h)。

Figure 2

三、探究持久性细胞增殖能力的实验设计

为了确定持久性细胞具有增殖能力的潜在机制,作者通过scRNA-seq在四个时间点(第 037 14 天)分析了 56,419 个单独的Watermelon-PC9 持久性细胞在osimertinib治疗的 14 天期间的表达(Figure 2a)。在第 14 天,通过 mCherry 表达将持久细胞分为三组:CyclingmCherry 低)、moderately cyclingmCherry 中)和non-cyclingmCherry 高)持久性细胞,并分别通过 scRNA-seq 对每一个细胞进行了分析。作者还利用公开的特征将每个细胞分配到特定的细胞周期阶段(Figure 2b),根据 scRNA-seq 检测到的barcode将细胞归为谱系(Figure 2c)。与其他时间点相比,作者观察到第 14 天的谱系多样性显著下降,即大多数细胞谱系在治疗后能够进入药物耐受状态。

四、持久性细胞命运依赖谱系

scRNA-seq 谱表明药物治疗后细胞状态逐渐变化,cycling和非cycling持久性细胞遵循不同的转录轨迹,一部分cycling持久性细胞类似于未经处理的细胞(Figure 2d左图中重叠浅粉色和黑色点)。在治疗过程中检查clone size动态性,Figure 2d中间的图显示cycling持久性细胞中克隆扩增增加最大。几乎三分之二的克隆只有一个命运,要么只是cycling,要么只是非cycling的持久性,而multi-fate的发生频率远低于偶然预期的。第 14 天的单个克隆的大小在两次独立重复之间高度相关(Figure 2e),表明每个持久性克隆在药物治疗下都具有独特的可重复增殖潜力。

五、活性氧(ROS)控制持久性细胞增殖

为了识别与持久性细胞增殖相关的过程,作者比较了不同持久性细胞亚组之间的差异表达基因,发现与非cycling持久性细胞相比,cycling持续性细胞表现出更高的谷胱甘肽代谢和NRF2 特征表达,而cycling持久性细胞具有更高的胆固醇稳态、干扰素α 和 Notch 信号特征表达Figure 2f)。作者将基因表达随时间与第 14 天的持久性克隆大小相关联。在早期时间点,没有基因与持久性克隆大小密切相关,而在第 14 天,一部分基因表达与持久性克隆大小相关(Figure 2g)。并且,这一部分基因中排名前十的基因是高表达的,其中五个是氧化应激诱导的转录因子 NRF2 的靶标(Figure 2h),这进一步支持抗氧化在持久性增殖命运中的作用。这与最近关于 NRF2 在微小残留病中的作用的报告一致,KEAP1(编码 NRF2 的负调节因子)的敲除增加了cycling持久性细胞的比例Figure 2i)。鉴于抗氧化剂表达特征与持久性增殖能力之间的密切关系,作者测试了延长的osimertinib治疗是否会诱导活性氧 (ROS) 以及缓解 ROS 是否会增强循环持久性。使用 CellROX(一种荧光 ROS 报告基因)对osimertinib处理的细胞进行分析,结果显示 ROS 水平随时间显著增加Figure 2j)。与观察到的两个持久性亚群之间的表达差异一致, 14 天的cycling持久性群体表现出不到非cycling群体中测量的 ROS 水平的三分之一(Figure 2k 此外,当通过从第 3 天起用 ROS 清除剂 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 处理(Figure 2l)或通过 GPX2 的稳定过表达(Figure 2m减轻 ROS 时,cycling持久性细胞的比例显着增加。相反地,通过抑制对谷胱甘肽合成至关重要的胱氨酸谷氨酸逆向转运蛋白系统的厄拉汀处理降低了cycling持久性细胞的比例(Figure 2n)。这些结果支持氧化还原平衡在调节持久性细胞增殖能力方面的作用。

六、循环持久性细胞代谢改变

由于氧化还原平衡与代谢密切相关, 作者进行了液相色谱质谱 (LC-MC/MS) 代谢分析以检查持久性亚群之间的差异。利用229 种量化代谢物进行主成分分析 (PCA) cycling持久性、非cycling持久性和未处理的群体分开(Figure 3a),三个群体之间有 56 种代谢物的丰度差异(Figure 3b)。特别是,线粒体β氧化底物的肉碱连接脂肪酸cycling组比非cycling组中显著富集(Figure 3c)。作者发现发现使用osimertinib处理的 FAO(脂肪酸氧化) 随时间增加(Figure 3d)。因此,cycling持久性细胞中酰基肉碱种类的丰度更高以及随着时间的推移,osimertinib治疗后 FAO 的增加都表明线粒体 FAO 可能有助于cycling持久性表型。接下来,作者探究FAO通路是否影响持久性细胞的增殖能力。发现过表达传递脂肪酸到线粒体的限速酶CPT1A,cycling持久性细胞的比例增加(Figure3e);利用CPT1A的抑制剂处理,可以显著降低cycling持久性细胞的比例(Figure3f)以及整体的持久性细胞的比例(Figure3g)。同时的,敲降CPT1C(在人类肺肿瘤中表达上调,CPT1A的异构体)降低了cycling 持久性细胞的比例(Figure3h)。这些结果表明FAO在形成增殖性的持久性细胞状态发挥了作用。

Figure 3

七、其他细胞系模型验证已有发现

为了验证作者的发现对其他持久性细胞是否具有普遍性,作者从 EGFR 驱动的肺癌(PC9 HCC827)、HER2 驱动的乳腺癌(BT474 EFM192A)和 BRAF 驱动的黑色素瘤(A375 COLO858)和结肠直肠 (HT29) 细胞系生成了七个Watermelon模型,用临床相关的激酶抑制剂(奥希替尼、拉帕替尼或达拉非尼)处理 10 天,根据 mCherry 水平对它们进行分类,并通过 scRNA-seq 对它们进行分析,产生 50,735 个单细胞图谱(Figure3i)。与之前的报告一致,单细胞图谱按细胞身份分组,而不是按处理分组(Figure 3j)。在所有模型中,持久性细胞表现出 G1 细胞周期停滞和cycling持久性细胞(与非cycling持久性细胞相比,存在 G2M/S 期细胞的总体比例更高),验证了Watermelon系统在多个模型中捕获这种罕见增殖群体的能力。

与非cycling细胞相比,cycling持久细胞显示出升高的脂肪酸代谢(FAM)特征(Figure 3k)。与来自相同模型的非cycling细胞相比,A375 黑色素瘤cycling持久性细胞表现出更高的抗氧化反应基因和 NRF2 特征的表达(Figure 3l,Figure3m)。相反,cycling HT29 和 HCC827 持久细胞上调这些 ROS 相关特征中的一个,但不是两个(Figure 3l,Figure3m)。与相同细胞系的非cycling细胞群相比,黑色素瘤(A375)和结直肠癌(HT29)cycling持久性细胞也表现出较低的 ROS 水平(Figure 3n)。因此,由致癌激酶抑制诱导的cycling持久状态在来自不同肿瘤类型的细胞系中具有相似的代谢和表达特征。

八、体内模型中验证已有发现

前面的研究都是在细胞水平得到的结果,作者接下来探究在动物模型中的情况。作者在携带EGFR基因的L858R突变,Trp53 敲除的osimertinib 治疗小鼠模型中的微小残留病灶中观察到与细胞系水平中相似的结果(Figure 4a)。RNA-seq结果显示治疗能够降低整体细胞周期以及EGFR信号标记;而最小残留病灶中上调了ROSFAM基因标记,这与体外实验的结果一致(Figure4b)。对一个30EGFR驱动的肺腺癌研究中scRNA-seq数据分析,发现从未治疗到残留病灶到疾病进展过程中展现了FAMROS通路标记物的得分逐渐增加(Figure 4c, Figure 4d)。ROS FAM 基因表达与增殖相关,并且cycling持久性细胞相比非cycling持久性细胞中的表达水平更高(Figure 4e,Figure 4f)。作者还发现肺腺癌中接受治疗的样本相比未接受治疗的样本,ROSFAM标志物之间会存在更强的相关性(Figure4g),并且在BRAF驱动的黑色素瘤以及HER2驱动的乳腺癌样本中都是只有接受治疗组中的ROSFAM标志物之间会存在强相关性,这表明癌基因抑制剂治疗与ROS FAM这两个通路相关,并且治疗组患者循环持久性细胞会经历代谢上的改变。

Figure 4

笔者总结

笔者认为这篇文章的意义重大,之前研究总是会提到肿瘤切除/治疗之后会有微小残留病灶,而这正是癌症复发转移的原因。这篇文章直接从体内体外证明了造成微小残留病灶的细胞的存在,即循环持久性细胞,这让我们对药物治疗后细胞状态的动态变化有了前所未有的了解。这将对于癌症治疗中的耐药以及癌症复发研究具有重要的意义。

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