【新手攻略】RNA pull down技巧

最近几年的非编码RNA热潮虽然已经不再新颖,但相信依旧有许多小伙伴们深陷其中,而最普遍的ceRNA机制已经不再受大家欢迎,RBP机制逐渐成为选择的方向,RBP机制最重要的一点就是检测与非编码RNA结合的蛋白质。检测RNA与其结合蛋白的重要技术方式就是RNA pull down。

这里就会有一个问题:RNA pull downRIP有什么不同,如何进行选择?

解决这个问题,首先我们需要介绍一下原理:RNA pull down技术是利用生物素标记的RNA和链霉亲和素标记的磁珠来高效富集及鉴定RNA结合蛋白。而RIP实验是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化对RNA进行分析。两者均为检测RNA和蛋白的相互作用,只是检测的形式不同而已。

(图片来源网络)

一、如何进行该实验,如何选择试剂盒?

万事开头难,相信很多小伙伴在刚开始进行实验的时候都咨询过一些试剂商,本人也询问过一些,有些试剂商直接建议全部外包实验,并包括后续的质谱检测。建议大家尽量不要选择这种方式,毕竟实验结果是真是假,不能得到很好保障,非常影响后续实验进展。

试剂盒的选择,本人在进行实验之前查阅很多文献,也在丁香园咨询过一些有经验的同学。小建议就是经费充足的可随意选择进口昂贵产品,如果经费普通,国产一些优秀试剂盒也是非常好用的(本人就是选择国产!)。无论大家选择何种试剂盒,都要提前了解操作步骤,并同时订购相关试剂(RNA探针等)。

(图片来源网络)

二、RNA pull down操作需注意!

1.实验前期准备

  1).首先是样本的收集和处理,如果样本是细胞,要考虑细胞中该RNA的表达量,如果RNA含量较低,那提取出来的RBP可想而知会非常少,建议大家提前准备较多的细胞。本人的试剂盒要求的量是107个细胞,实验操作时使用了8个10cm大皿。)也看到很多小伙伴说可以先进行过表达该RNA后再进行pull down实验,大家可以尝试。

  2).由于该实验我们提取的目的蛋白和细胞中的RNA含量都较低,因此更需要注意的是:实验操作过程预防RNA和蛋白的降解!进行实验的前两天,一定要准备好实验需要的枪头,EP等。均需无酶无菌!提前高压,做好准备,实验进行时,戴好手套和口罩!实验操作台提前使用DEPC水擦拭!剩余耗材准备:磁力架,碎冰,低温高速离心机,冰盒,漩涡振荡器。

2.实验操作重点

实验的操作,大家可以根据自己购买的试剂盒说明书严格进行。一般均包括以下几个关键步骤。

  1).探针的制备:这步强烈建议大家交给靠谱的公司进行构建,便宜好用易上手!

  2).探针-磁珠制备:按照说明书进行操作,没有任何问题。

  3).蛋白样本的提取,除核酸:即制备蛋白样本。如果设计的组较多,可以选择分别提取,每次提取的蛋白样本可短时间内,冻存于-80度冰箱低温保存

  4).RNA pull down:同样是按照说明书进行。重点:到最后一步孵育洗脱后收集上清(即最终样本),大家可以根据自己的情况,加适当量buffer(减少量)!例如本人试剂盒上写60ul,但加上60ul后,蛋白浓度太低,以至于后续实验进行有些困难。

(图片来自网络)

三、后续实验安排有哪些?

1.质谱实验

收集的蛋白样本进行质谱检测是大多数小伙伴的选择。质谱检测一般需要试剂公司进行,这项服务国内有很多公司进行选择。需要大家提前联系好如何进行送样更方便检测。本人选择公司建议送胶条样本,需要自己进行蛋白电泳,tip!:样本一定要全部上样。本人即使制备大量细胞,后续buffer加入较少,但考马斯亮蓝染色后,条带也是非常浅,但只要能够看见条带,即可进行质谱检测!

2.蛋白检测(WB实验)

WB蛋白检测即为常规检测。

3.银染实验

大多数文章中都有非常漂亮的银染图片,本人就是被此吸引,但操作过程中发现非常多的要点!

  1).首先,市面上有较多好用的银染试剂盒可供大家选择。小伙伴们可以直接购买,如果实验室试剂较全,也可自己制备。

  2).银染实验过程中使用的水,非常重要!!一定要选择去离子水或三蒸水!!!(本人嫌麻烦中间步骤使用过自来水,结果非常糟糕。)

  3).染胶的器材,皿或托盘提前处理,洗干净后,使用超纯水冲洗

  4).银染过程中,洗涤显色时,条带刚显现或背景开始变为淡黄色,即需要终止反应,否则背景会非常深。

(图片来自网络)

最后,好的实验数据需要每个实验人自己尽心去做,如果小伙伴们对RNA pull down实验抱有尝试的心态,那么细心查资料,准备实验都会有好的收获。RNA pull down并不困难,小伙伴们冲呀!

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