肿瘤干细胞+m6A:干细胞顶刊的联合热点研究思路

急性髓系白血病(AML)是一种致命的造血系统恶性肿瘤。白血病干细胞/祖细胞(LSCs/LICs)具有无限的自我更新/再生潜能,被认为是AML疾病发生、发展以及复发的根本原因。N6-甲基腺苷(M6A)是mRNA修饰的最常见方式之一,参与了诸多疾病的生理和病理过程,包括造血功能和白血病的发生与发展。ALKBH5是RNA m6A去甲基酶,参与肿瘤的发展和肿瘤干细胞(CSCs)的自我更新。今天笔者就带来一篇关于ALKBH5通过m6A影响急性髓系白血病中肿瘤干细胞的自我更新的文章,这篇文章发表在Cell Stem Cell(IF=20.86)上,让我们来看看发表在干细胞顶刊的文章到底做了哪些实验吧。

1.ALKBH5在AML中高表达,

其表达增强与患者预后不良相关

首先作者基于AML患者队列和正常队列的基因表达谱数据集发现ALKBH5在AML各亚型中的表达水平明显高于正常造血干细胞(HSC)。

WB数据还显示,在TP53野生和突变型AML细胞系中ALKBH5蛋白水平相似,但两者都高于正常对照细胞。此外ALKBH5的高表达与AML患者的总生存期缩短有关。随后作者构建了ALKBH5敲降细胞,发现其 m6A水平显著增加,并且抑制生长和诱导凋亡。相反过表达ALKBH5显著促进了人AML细胞的生长。

结论:ALKBH5在AML中高表达且与预后不良相关。

2.癌基因诱导的细胞永生化和白血病发生
需要ALKBH5

作者进一步构建了Alkbh5敲除小鼠,通过液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)检测,发现Alkbh5 KO鼠骨髓中有较高的m6A丰度,这与Alkbh5的m6A去甲基酶活性一致。为了研究ALKBH5在白血病细胞转化和白血病发生中的需求,采用了MLL-AF9(MA9)介导的细胞转化(集落形成/永生化)和白血病发生模型进行下一步研究。MA9可以将造血干/祖细胞快速诱导成为永生化AML细胞,所以作者发现Alkbh5 KO后抑制了MA9介导的细胞永生化,过表后结果相反。小鼠骨髓移植(BMT)试验显示,Alkbh5敲除后延迟了白血病的发病时间,延长了受体小鼠的生存时间,并且在Alkbh5 KO鼠中显著抑制了MA9转化的细胞在外周血、骨髓和脾脏的定植数量。

结论:ALKBH5的表达可以诱导AML的发生

3.ALKBH5表达缺失对急性髓系白血病细胞

再增殖和急性髓系白血病维持的影响

为了确定ALKBH5是否也是AML维持所必需的,作者在AML亚型的白血病细胞中敲降ALKBH5发现显著抑制了细胞集落数量、集落大小和细胞数量。二次骨髓移植试验表明,敲除Alkbh5显著抑制了MA9诱导的小鼠急性髓系白血病的进展。接下来,进行了体外(CFA)和体内异种移植模型试验,ALKBH5敲降后显著减少了人急性髓系白血病细胞的集落数量和大小,并且延缓了人类AML的进展,延长了受体小鼠的存活时间。ALKBH5基因敲除也显著抑制了人原代AML细胞的生长和集落形成能力,并促进了人AML细胞和CD34+原始细胞的凋亡。

结论:表明ALKBH5对于急性髓系白血病的维持是必需的。

4.ALKBH5表达缺失损害了白血病干细胞/

祖细胞(LSC/LIC)自我更新

在AML患者中,耐药性和复发与LSCs/LICs相关。接下来,作者发现Alkbh5 敲除显著抑制了原代AML细胞在体内的增殖能力,并阻止了二次骨髓移植受者的AML发病,这表明ALKBH5是LSC/LIC再增殖所必需的。作者进行了体内和体外有限稀释试验(LDAs)发现Alkbh5基因敲除后显著降低了小鼠MA9细胞的LSC/LIC再增殖频率。

结论:ALKBH5是LSC/LIC细胞自我更新所必需的。

5.Alkbh5缺失不会显著影响正常造血功能

接下来,作者发现Alkbh5缺失不会对HSC功能和多系造血发育造成任何不利影响。随后作者进行了体内竞争实验,(将WT或KO供体小鼠(CD45.2+)和竞争小鼠(CD45.1+CD45.2+)的骨髓细胞移植到致死性照射的受体(CD45.1+)中,并监测全血细胞计数和移植到外周血中的情况),结果显示 KO小鼠的BM细胞有较高的重建能力并且祖细胞和分化的细胞数量略有增加。

结论:ALKBH5在造血过程中维持正常的HSC自我更新的作用不大。

6.急性髓系白血病中ALKBH5潜在靶点的识别

为了揭示ALKBH5在AML中的作用机制,作者进行了转录组范围的RNA测序(RNA-seq)、RNA免疫沉淀(RIP-seq)和m6A测序(m6A-seq)。RNA-seq显示出敲降细胞的差异基因并富集到凋亡和p53通路等。RIP-seq显示,多数ALKBH5结合位点位于蛋白质编码转录本中,并且结合靶点在细胞周期和增殖相关途径中含量丰富。m6A-seq数据显示,绝大多数m6A峰分布在AML细胞mRNA转录本的蛋白编码区(CDS)和3’UTR区。之后对RNA-seq、RIP-seq和m6A-seq数据的综合分析,通过qPCR,RIP-qPCR,m6A-qPCR验证确定了18个ALKBH5潜在靶点。

7.TACC3是ALKBH5在AML中的
直接和重要功能靶点

经TCGA数据库分析,在18个基因中TACC3在AML中显示出预后不良。在原发AML样本中,TACC3与ALKBH5的表达呈显著正相关。同时验证了在ALKBH5被敲除后,TACC3转录本的表达水平显著降低,m6A丰度显著增加。相反,过表达ALKBH5后会增加TACC3的表达。小鼠BM细胞和小鼠MA9 AML细胞结果相同,并且TACC3的表达仅受ALKBH5调控。因此,我们的数据表明TACC3是ALKBH5在AML中的特异性靶点。

作者发现ALKBH5基因敲除导致了AML细胞mRNA转录的半衰期缩短,这些基因都与细胞周期和细胞生长/增殖相关。随后作者证实在ALKBH5敲降细胞中显著降低了TACC3mRNA的半衰期,而过表达细胞结果相反。

有报道称,TACC3可调节正常或癌细胞中的MYC和P21水平。作者也同样发现,ALKBH5基因敲除同样也导致了MYC减少和P21增加。提示ALKBH5/m6A/TACC3轴在AML细胞中也调节P21和MYC通路。

因此,作者开始研究TACC3的功能重要性。首先TACC3基因敲除也显著抑制细胞生长并诱导人AML细胞凋亡。Wb显示TACC3基因敲除后,人AML细胞的MYC降低,P21升高。接下来,作者发现Tacc3基因的敲除抑制了小鼠MA9 AML细胞的生长和克隆形成能力。我们的体外LDAS表明,Tacc3基因敲除显著降低了小鼠MA9 AML细胞的LSC/LIC频率。此外,挽救实验表明ALKBH5基因敲除对细胞生长的抑制作用可以通过过表达TACC3可以部分挽救。

结论:TACC3是ALKBH5在AML中一个真正重要的功能靶点。

笔者总结

这篇文章可以说是一个非常系统和完整的工作了。从前期的立项依据来看,急性髓系白血病预后差耐药等临床难题急需解决,而其中肿瘤干细胞发挥着巨大的作用,也有文献报道m6A参与白血病的发生和影响肿瘤干细胞的自我更新,所以推测m6A影响肿瘤干细胞进而影响白血病的发生及预后,立项逻辑清晰,既有领域内科学难题,又有探索创新型。从结果上来看,前期利用TCGA数据库及多种敲降细胞验证基因与疾病间的关系。随后在细胞及动物水平上进行了体内外的表型验证。后期在下游机制方面,首先利用多组学联合分析筛选出下游基因,策略充实可靠。之后对下游基因同样进行表型验证,最后利用临床样本回归临床,完整收尾,实现了高分文章的临床—基础—临床的结构。同时文章中实验分组细致合理,对于我们理清科研思路,学习借鉴都是一篇非常好的文献。

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