【课题套路】掌握信号通路经典套路——解析负反馈环路

疾病分子机制的研究绕不开信号通路,信号通路中某分子单向促进或者抑制下游分子是常见的研究主题,而负反馈环路也是经典的信号通路调控之一,涉及到两个及以上的分子,可以为文章增色添彩。下面让我们一起看看这篇这篇近期发表在子刊Cell Reports上研究热门HIPPO通路的文章吧。

 

2020年10月20日,中国科学院分子细胞科学卓越创新中心张雷课题组报道了Hippo信号通路关键成员YAP孤儿核受体NR4A1形成的负反馈环路能够精确控制细胞增殖和凋亡的平衡,以调控器官大小和维持组织稳态。

文章概念图

 

上述图可以看出作者的思路清晰,证明了以NR4A1和YAP为主的反馈环路,下面我们一起来解构作者的结果,理解作者的思路。

研究背景

1、Hippo 通路进化保守,可通过调控细胞增殖、凋亡及干细胞自我更新来控制器官大小。此外,Hippo 通路的失调会导致癌症发展。Hippo 通路包括Mst1/2激酶LATS1/2,转录共激活因子 YAP 和 TAZ。YAP去磷酸化后,YAP/TAZ转运到胞核,并与TEAD1-4及其他转录因子发生相互作用,从而诱导促进细胞增殖并抑制凋亡的基因表达。

2、NR4A1Nur77,TR3NGFIB)是一种孤儿核受体,属于类固醇/甲状腺/类维生素A受体超家族,包含DNA结合结构域(DBD)和配体结合结构域(LBD)。可通过线粒体定位以及与Bcl-2的结合在促凋亡功能中发挥重要作用

图片来源于Cell signal官网

研究内容

1、首先作者通过数据库的筛选找到了Hippo通路中差异表达的分子NR4A1。通过敲除这个通路中重要的效应因子YAP蛋白,然后从RNA测序(RNA-seq)Venn绘图分析以及染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据筛选到了主要研究分子NR4A1,并从mRNA和蛋白水平在多个人源细胞系以及小鼠模型中进行证明。

1 NR4A1是Hippo通路的靶点

2、紧接着作者把这个筛出来的分子在转录水平上研究了一通,发现调控NR4A1的一些条件:前面检测了CHIP-seq数据,发现NR4A1在启动子区域有TEAD4结合域,通过荧光素酶报告实验,发现YAP/TAZ-TEADs复合物抑制NR4A1的转录。

图2 YAP/TAZ-TEADs在转录水平上通过招募NuRD复合物来抑制NR4A1

3、接下来作者查阅文献,猜测另一条热门通路可以发展一些故事。Hippo-YAP信号可以激活PI3K-AKT途径,作者推测Hippo信号也与AKT参与NR4A1磷酸化有关,找到了凋亡这一表型,并使用免疫组化,免疫荧光等,通过条件敲除的动物模型进行了验证。

3 YAP促进NR4A1磷酸化并通过AKT抑制其促凋亡功能

上述结果主要证明,YAP促进NR4A1磷酸化和核定位,并通过AKT抑制其促凋亡功能

4、经过前面的探索,作者发现了促凋亡功能和抗肿瘤作用,接着进一步开始研究NR4A1Hippo通路中到底扮演什么角色。通过细胞和动物模型,探究了沉默这个分子后,通路的各种变化。

4 NR4A1促凋亡功能和抗肿瘤作用

上述数据证明NR4A1通过其线粒体定位和与Bcl-2的结合促进细胞凋亡和肿瘤抑制。

5、弄清楚了部分NR4A1的促凋亡和抗肿瘤的作用机制,作者还想拓宽其生理意义,所以建立了部分肝切除术的小鼠模型,进行了生理机制的探究。

5 YAP介导的NR4A1调节在肝再生过程中很重要

6、经过了前面的探究,终于到了文章最关键的反馈机制的证明部分啦。这部分的关键在于证明YAP可以影响NR4A1,同时反过来又受到NR4A1的负反馈调控,即NR4A1含量高时,间接促进YAP降解。YAP激活时,抑制NR4A1功能。两者之间达到了制衡的状态。 

作者在几种癌细胞系和小鼠模型中观察到NR4A1的过表达明显降低了YAP蛋白水平,敲除NR4A1后YAP蛋白水平增加。然后通过检测YAP蛋白泛素化,探究了YAP蛋白的稳定性。

6 NR4A1通过增强YAP和14-3-3结合促进YAP降解作为反馈

7、研究了这么多机制的故事,最后的立足点还是基础转化到临床层面。那么这个课题的意义在哪里呢?作者对治疗策略进行了探究。使用小鼠异种移植瘤模型进行试验,发现靶向敲除NR4A1果然可以治疗肿瘤。

7 NR4A1的激活是有效治疗策略

总结
这篇文章的亮点在于揭示了Hippo经典通路中未知的负反馈环路。而且机制了解得比较清楚,涉及到两个主要分子(NR4A1YAP)以及一个细胞器(线粒体);除此之外,还运用到多种小鼠模型:cre诱导模型、异种移植瘤模型、从头诱导肝癌模型(a de novo tumorigenesis model,动物实验部分,肝部分切除术、流体动力注射(sleep beauty)建模等等概念,都很特别。我们从中可以学到负反馈研究的套路和小鼠模型的建立。相信认真研读后的大伙儿一定很有收获。
文章还可以更好的地方是整体的结果分布思路较跳跃,找到NR4A1后,又联系到AKT和其磷酸化促凋亡功能,接着跳到抗肿瘤,然后是肝再生的生理功能。如果结果之间的衔接更流畅,理解起来可能会更容易。
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