【课题反套路】Developmental Cell肿瘤与自噬研究新思路

最近肿瘤免疫的研究很火,CNS等各大顶刊都刊登了许多关于免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用和影响。然而,要做肿瘤免疫相关研究其实并不简单,不仅要将肿瘤组织进行原代分离和两种细胞的体外共培养实验,必要时还要做单细胞测序,这对于大部分科研刚起步,经费又紧张的小伙伴来说并不友好。可是肿瘤的常规研究套路,比如增殖侵袭转移那些,都太过陈旧,是否有什么新思路可以借鉴呢?

这就为大家介绍一篇今年发表在《Developmental Cell》上的文章,题为“Autophagy Blockade Limits HER2+ Breast Cancer Tumorigenesis by Perturbing HER2 Trafficking and Promoting Release Via Small Extracellular Vesicles”,关注的是自噬和HER2+乳腺癌的关系但在思路上却独辟蹊径地将自噬与小细胞外囊泡(eEVs)相结合,让人眼前一亮。

研究思路

一、研究背景

乳腺癌已成为目前女性的第一大癌症“杀手”,2021年最新研究报告显示乳腺癌发病率已超过肺癌居全球首位。根据乳腺癌细胞表达的受体类型,可将乳腺癌分为HER2阳性/阴性、雌激素受体(ER)阳性/阴性、孕激素受体(PR)阳性/阴性。目前已有针对HER2阳性(HER2+)的靶向药物并取得不错的疗效,但依然存在耐药问题。以往研究发现自噬能促进HER2抗体药物的耐药性,但具体机制尚不清楚。因此,本研究对自噬促进HER2阳性乳腺癌细胞耐药机制展开研究。

二、研究内容

1. 在小鼠中敲除或突变自噬相关蛋白FIP200有效抑制自噬和乳腺癌发生

首先就是要看一下自噬和乳腺癌的发生到底是什么关系。这里作者针对FIP200(又名RB1CC1)构建了FIP200条件性敲除小鼠和FIP200突变体敲入小鼠,而这两种小鼠是基于HER2阳性乳腺癌模型小鼠进行编辑构建的。FIP200能够与ATG家族蛋白直接结合,促进自噬小体的形成。敲除或突变FIP200后可以看出,小鼠的乳腺癌几乎不发生,p62显著表达,Akt磷酸化程度降低,与对照相比HER2表达量极低。

2. 抑制自噬降低乳腺癌细胞中HER2的表达(体外)

在动物模型中初步证明后,作者又在体外细胞系中进行验证,并构建了FIP200-/-和FIP200+/+肿瘤细胞系(纯合)。结果与体内实验一致:敲除FIP200后HER2表达量显著下降,自噬受到抑制。为了检验这两种细胞的成瘤效果,作者又将这两个细胞系接种到相同背景的小鼠中,结果同样是接种敲除FIP200细胞的小鼠生存率更高,肿瘤生长更慢。

由于FIP200的功能不只有调控自噬,因此作者在乳腺癌肿瘤细胞中敲减自噬相关的另两个蛋白ATG5和ATG13,自噬通路同样被抑制,且HER2表达降低,表明FIP200通过自噬维持HER2的表达。

3. 自噬缺乏抑制HER2的上膜表达

搞清楚自噬对HER2的作用,接下来就要研究一下具体的调控机制了。首先想到的肯定是自噬是否下调HER2的转录和蛋白降解。然而令人意外的是,转录水平和蛋白稳定性都没有显著差异。通过免疫荧光染色和流式检测发现,细胞膜上HER2的表达显著降低,且HER2在细胞内成弥散性点状分布,暗示抑制自噬影响了HER2在细胞内的运输。

4. 抑制自噬改变HER2细胞内运输,从高尔基体运至内体而非细胞膜

接下来就要探索一下自噬究竟如何决定HER2的蛋白上膜运输。为了更好地观察HER2蛋白的运输路径,作者使用了HER2和内体标志蛋白RAB7双荧光标记。在FIP200敲除细胞中,HER2和RAB7出现共定位。将另一内体标志蛋白RAB5突变后,内体变大并包含更多HER2。使用高尔基体标记蛋白发现抑制自噬后HER2聚集在高尔基体内,表明自噬缺陷造成HER2在高尔基体的积累以及往内体的运输。

5. 抑制自噬使HER2通过小胞外囊泡形式排出细胞,减少膜表达

晚期内体存在一种机制,即形成多泡小体(MVBs)并通过管腔内囊泡(ILVs)胞吐方式排到细胞外。用ILVs的标志物CD81和CD63进行共定位就会发现,只有FIP200或ATG13敲除后HER2才会和ILVs共定位,表明HER2很有可能被外排到细胞外。

正如外泌体的研究,必然需要检测细胞培养液中的囊泡以及包含蛋白的表达量。结果显示,FIP200和ATG13敲除细胞的sEVs中HER2蛋白量显著高于对照组,荧光也显示细胞外小囊泡中的HER2显著增加。

三、总结

读完这篇文章就会发现,真正新颖的研究常常在意料之外。如果在检测HER2的转录水平和蛋白稳定性得到无差异结果后就放弃,那么就无法发现后来如此有趣的机制。当然,整篇文章从开头的动物模型构建到之后的体外细胞实验和蛋白定位研究,都排除了其它通路或机制的可能性,可谓十分严谨了。这一新机制的发现有助于解开HER2阳性乳腺癌的完整机制,具有很强的临床意义。

此外,无花果觉得本文中漂亮高清的荧光图也是重要的加分项。有研究细胞内运输,尤其是囊泡运输、外泌体的小伙伴们如果不想再做套路化的机制,不妨借鉴一下。

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