【科研套路】如何研究肿瘤微环境与肿瘤转移的关系

绝大多数与乳腺癌相关的死亡是由于远处器官的转移,越来越多的研究发现肿瘤微环境由多种细胞和非细胞因素组成,在肿瘤转移中起着重要作用。中性粒细胞是存在于肿瘤微环境的异质白细胞,调节肿瘤存活迁移、免疫反应和血管生成而促进肿瘤进展和转移。今天笔者带来的文章讲述了组织蛋白酶C通过调节早期转移微环境中中性粒细胞的浸润和中性粒细胞形成的细胞外诱捕网(NET)形成来促进乳腺癌的肺转移。文章发表在Cell出版社旗下Cancer Cell(IF=26.6)期刊上,对于想要研究肿瘤微环境的小伙伴可以学习参考一下。
1.CTSC分泌与乳腺癌的肺转移相关

首先作者对不同肺转移能力的乳腺癌细胞系进行了质谱(MS)分析发现 组织蛋白酶CCTSC是受调控的蛋白质之一,进一步分析证实其在肺转移癌细胞中的表达升高,并且发现CTSC在原发肿瘤中的高表达与患者的总生存期缩短有关。此外,作者观察到与原发肿瘤相比,肺转移瘤中CTSC表达上调,并且血清CTSC水平高的患者易发生肺转移。

结论:CTSC与乳腺癌肺转移呈正相关。

2.CTSC促进乳腺癌的肺转移

作者构建了CTSC过表细胞系,在静脉接种癌细胞到小鼠体内后,显著加剧了肺转移,并缩短生存时间,其他过表细胞系结果相同将过表癌细胞进行裸鼠荷瘤实验,肺转移明显高于对照之后将敲降细胞移植到鼠的乳房脂肪垫中,结果发现CTSC对原发肿瘤生长没有影响,并且减弱了肺转移水平

结论:CTSC在乳腺癌中具有促进转移的作用。

3.CTSC为肿瘤细胞在转移前期的增殖做好准备

生物发光成像(BLI)分析显示,CTSC过表细胞在静脉接种后第一周就已经显著升高。肺切片IF染色也显示在注射早期CTSC过表达的癌细胞在肺实质内种植增多在第2天后开始稳定,表明CTSC诱导的癌细胞在肿瘤起始期增殖。EDU标记检测了CTSC过表达细胞的增殖数量高于对照细胞。相反CTSC基因敲除导致接种的癌细胞增殖数量显著下降。此外还发现CTSC基因敲除还能抑制癌细胞在转移后期的转移生长。

结论:CTSC在肿瘤转移前期促进癌细胞增殖。

4.中性粒细胞介导肿瘤CTSC的促转移作用

为了探索CTSC如何调节肺转移,作者发现CTSC过表达或敲低后体外细胞的生长,凋亡,迁移,侵袭和肿瘤球均未受到影响,所以作者重点研究了中性粒细胞、巨噬细胞等肿瘤微环境的变化。流式细胞仪分析显示,CTSC过表达提高了肺转移瘤中中性粒细胞和巨噬细胞的百分率。然而,在转移的早期阶段,CTSC只调节中性粒细胞的浸润。肺转移早期的肿瘤细胞组织免疫染色进一步证实周围有丰富的中性粒细胞。此外,肿瘤细胞的增殖与其周围中性粒细胞的聚集呈正相关。之后作者在小鼠特异性地耗尽中性粒细胞后发现CTSC促进的癌细胞早期的植和增殖被减弱,小鼠肿瘤的转移减少和生存时间延长。

结论:CTSC在肺转移中的促进作用是通过增加中性粒细胞募集来实现的。

5.CTSC通过激活中性粒细胞PR3-IL-1b-NF-kB

促进中性粒细胞募集

接下来,作者探究CTSC是如何影响中性粒细胞募集的。作者在体外发现CTSC的过表与敲除不能影响募集中性粒细胞的能力。然而,当中性粒细胞被含有CTSC的癌细胞培养基处理,能够吸引更多的中性粒细胞聚集,这表明肿瘤来源的CTSC可能调节某些趋化因子作用于中性粒细胞。作者进一步研究了肿瘤CTSC作用于中性粒细胞的分子机制。有研究报道PR3CTSC的底物作者发现PR3表达中性粒细胞的胞膜上。PR3抑制Sivelestat减弱了CTSC的作用,并且有效地消除了CTSC诱导的中性粒细胞募集,同时也减少了中性粒细胞在早期转移微环境的浸润和CTSC过表癌细胞在肺部的转移定植。有研究报道CTSCPR3参与白细胞产生成熟的IL-1b。作者发现CTSC过表癌细胞的培养基可以促进中性粒细胞中IL1b的成熟和分泌,而敲降细胞结果相反,CTSC的这种作用可以被Sivelestat恢复。此外,在CTSC敲降细胞中加入PR3可以恢复中性粒细胞对IL-1b的处理和释放,说明 CTSC通过PR3调节中性粒细胞产生IL-1b同样,作者通过过表及一系列挽救实验证明了肿瘤来源的CTSC能够激活NF-kB信号并上调中性粒细胞中NF-kB靶基因IL-6CCL3的表达。

结论:CTSC通过激活中性粒细胞PR3和促进IL-1b-NF-kB信号来增强中性粒细胞的趋化作用。

6.CTSC通过激活p38和促进中性粒细胞

产生活性氧来诱导网状形成

作者进一步研究了中性粒细胞在被招募到转移微环境时是如何调节转移的。作者发现在CTSC过表细胞的培养基中中性粒细胞形成细胞外诱捕网(NET),敲降细胞结果相反,在荷瘤小鼠中发现同样结果。有研究报道活性氧(ROS)对NET起关键作用。作者同样验证过表CTSC的癌细胞促进了中性粒细胞的ROS产生,而Sivelestat则抑制了ROS的产生。有报道p38MAPK可以被IL-1b激活以触发ROS的产生,所以作者发现癌细胞中的CTSC和PR3蛋白可刺激中性粒细胞p38磷酸化,该作用也可被IL-1b抑制作用阻断。此外,抑制p38信号,也能够抑制CTSC对中性粒细胞产生ROS的影响。

结论:CTSC通过调节中性粒细胞的IL-1b-p38-ROS轴而促进NET代谢。

7.Net支持癌细胞的转移性生长

之后作者探究NetsCTSC诱导的肺转移中的作用。首先作者SivelestatDNase I治疗荷瘤小鼠,发现可以减少癌细胞在肺部的转移并减弱CTSC的作用。在体外实验中CTSC诱导的Nets培养基处理肿瘤球体的生长得到了极大的促进。有文献报道炎症激活的中性粒细胞可以降解抑制转移的细胞外基质蛋白TSP-1。作者同样利用过表细胞及挽救实验验证了TSP-1肺组织表达减少。此外,TSP-1抑制肿瘤细胞的球状生长,但可以被Nets培养基逆转,挽救实验表明DNase I消化Nets可抑制Net对球体生长的促进作用。之后作者观察到CTSC诱导中性粒细胞表达和分泌IL-6。用抗体抑制IL-6也部分阻断了CTSC调节的中性粒细胞在球体生长中的促进作用,而同时用DNase IIL-6抗体处理则完全中和了CTSC的作用。

结论:Nets降解TSP-1蛋白和中性粒细胞分泌IL-6可以促进CTSC诱导的癌细胞转移生长。

8.中性粒细胞和Net
与乳腺肿瘤CTSC表达和转移相关

接下来,作者评估了中性粒细胞浸润和Net形成在人类乳腺癌肺转移中的临床相关性。免疫荧光显示,肺转移瘤的中性粒细胞浸润和Net产生高于原发灶,并且CTSC的表达与中性粒细胞浸润和Net结构密切相关。同样在三阴性乳腺癌和管腔型乳腺癌中有高水平的CTSCNets。此外,肺转移性肿瘤患者的循环净值高于非转移性肿瘤患,与血清CTSC水平呈正相关。对NKI乳腺癌临床队列的公共基因表达数据集分析发现,几个已发表的中性粒细胞基因集的表达都与CTSC的表达呈正相关。

结论:在人类临床乳腺癌中CTSC的表达与中性粒细胞浸润和Net形成有关。

9.AZD7986靶向CTSC预防小鼠肺转移

作者最后探究靶向CTSC是否可以成为治疗转移性乳腺癌的有效策略。作者选用CTSC第二代抑制剂AZD7986,发现口服AZD7986荷瘤小鼠原发肿瘤的生长没有影响,减轻了转移模型肺转移。在接受AZD7986治疗的小鼠中没有观察到严重的副作用,并且有效地恢复了体重延长了动物存活时间。此外,AZD7986还能抑制小鼠循环中IL-1b的水平。

结论:CTSC可以调节肿瘤相关中性粒细胞,并提示CTSC可能作为乳腺癌肺转移的治疗靶点。

笔者总结

近年来肿瘤领域中肿瘤干细胞与肿瘤微环境越来越成为研究热点,肿瘤干细胞因自身的干细胞特性造成了肿瘤复发与肿瘤耐药,而在肿瘤微环境中充斥着恶性癌变细胞和健康未转化细胞,这十几种细胞相互作用创造了肿瘤微环境,正是这些细胞分泌的细胞因子、趋化因子、生长因子等为肿瘤转移提供了良好条件。在肿瘤高分文章中几乎所有的工作都遵循:发现领域内/临床中普遍存在的难以解决的问题+细致的实验严谨的分组清晰的思路+最后回归临床问题,以解决领域难题为意义。从这篇文章来看,首先作者通过乳腺癌易转移为问题导向同时结合肿瘤微环境促进转移找到研究方向。其次在实验方面作者通过获得和缺失进行表型鉴定,恢复实验进行验证,多个实验验证同一结果。从其他文章中提炼思路进行更为细致的研究。最后回归临床,通过临床样本及数据库进行验证,并且初步探索在临床中可以作为治疗靶点。整篇文章思路清晰,结构完整,既有临床数据支撑又有基础研究意义,所以值得大家学习参考。

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