【科研套路】空间转录组学研究思路

基因表达具有时间特异性和空间特异性。时间特异性通常可以通过对不同时间点的样本取材,再使用单细胞转录组测序技术来进行解析。然而,空间特异性信息常常难以获得。常规转录组测序和单细胞转录组测序无法还原细胞所处的原始位置信息,而传统的原位杂交技术又很难实现高通量检测。近年来兴起的空间转录组学技术可以解决这个问题。让小编带你解读下这篇来自号称“科研套路”宝藏期刊Nature Communications的文章,希望你能很快上手运用空间转录组学研究基因特异性时空表达调控的科研思路。

大脑内基因表达的选择性剪辑(alternative splicing,AS)相比其他组织更具多样性,剪辑因子和其他RNA结合蛋白的脑区特异性表达模式驱动着脑区的特异性剪辑,如脑疾病相关基因MAPT,Bin1和轴突蛋白基因Neurexin。脑区基因的亚型特异性表达可以是同一基因在一种或多种细胞类型中的分子调控差异,也可以是基因表达或细胞类型丰度差异而无需AS调控。这些不同的基因时空表达模式在新生动物的发育过程中尤其重要。例如,在海马(HIPP)和前额叶皮层(PFC)中,多种细胞类型的分化受到因发育特异性的AS影响。

但是,由于测序通量和测试方法的限制,迄今为止尚无跨大脑区域的细胞类型特异性的基因AS研究。HIPP和PFC是脑中高度特化和分工的区域,它们的神经环路与大脑的运动控制、认知、学习和记忆形成密切相关。涉及HIPP和PFC的疾病往往导致认知缺陷,因此了解这些脑结构在关键发育时间点发生的基因表达变化对于理解神经系统疾病的发生和发展机制至关重要。

在本文中,作者采用单细胞亚型RNA测序(ScISOrSeq),在小鼠出生后第7天(P7)时,增加对HIPP和PFC的测序通量,以测试和定义细胞类型对脑区域特异性AS的贡献。此外,研究还设计了一种测定基因空间特异性亚型表达的方法,该方法除增补了艾伦发育中脑图集的现有空间基因表达图谱之外,还提供了一个空间外显子表达图谱(请参见www.isoformAtlas.com)。 

下面,就让我们来学习下这篇文章的研究思路吧:

P7小鼠海马和前额叶皮层组织中的短读长片段是已知成年细胞类型中的基因前体

研究利用ScISOrSeq技术标记单细胞,然后进行短读长片段簇和长读长片段簇分析,以揭示特定于细胞类型的剪辑体(图1a)。在HIPP中,研究发现了24个簇的特征性标记并鉴定出八种神经胶质细胞类型,包括两个星形胶质细胞、三个少突胶质细胞、放射状神经胶质样(RGL)细胞、纤毛室管膜和分泌性脉络丛神经上皮(CPE)细胞簇。另外,还观察到六个与血管和免疫相关的细胞类型群,包括血管内皮细胞,小胶质细胞和巨噬细胞(图1b)。

类似地在PFC中,分析揭示了七个胶质细胞簇,包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、六种血管和免疫细胞群以及七种神经元类型(图1c)。

图 1

同一种基因的差异表达(differential isoform expression, DIE)研究

接下来,研究对单细胞中的全长HIPP和PFC cDNA进行了长序列测序,并使用单细胞条形码(图1a)对每种细胞类型的去卷积读码进行了两次独立复制(图S3, SS3)。采用外显子2×2列联表的方法成功评估了两种情况下外显子转录的差异。通过此法,在HIPP和PFC中发现了31个外显子差异表达的基因(占总数的1.45%,n = 2132)。

与基于外显子发现的31个重要基因相反,当使用基因水平测试比较HIPP和PFC同工基因型时,有395个基因(FDR <= 0.05,ΔΠ≥0.1; 9.06%; n = 3958)表现出DIE。

由于基因水平测试考虑了外显子的连通性,因此可以确定导致DIE的确切同工基因型。在发生DIE的395个基因中,选取每个基因两个最重要贡献的亚型,鉴定出了76个高可信度新型基因同工亚型。在功能上,有40个(52.6%)是编码转录本,有24个(31.6%)显示为无义介导的衰变(NMD),有11个(14.5%)显示为内含子保留,有1个同工型是一个长的非编码基因(Meg3)(图2f)。这些非编码和NMD转录本提示基因的表达受空间区域特异性调控。

图 2

跨大脑区域的DIE基因表达主要受一种特定的细胞类型支配

由于抑制性神经元之间在转录上比兴奋性神经元更为相似,因此作者将所有抑制性神经元亚型(IN1,IN2,IN3)合并为复合抑制性神经元(IN)类别,而兴奋性神经元亚型则分仍分组为兴奋性神经元(EN)类别。本研究提出了三个AS模型,它们可能是大脑区域之间基因差异性表达的基础:1)在多种或所有细胞类型中都存在的剪辑体(“ Both-Cell-Types-Model”);2)仅在单个细胞类型中变化的剪辑体(‘Single-Cell- Type-Model’);和3)仅在表达层面或细胞类型丰度层面发生变化,而剪辑体本身并没有变化(‘No-Cell-Type-Model’)(图3a)。

图 3

脑区微环境的影响掩盖了一些基因的细胞类型特异性

尽管存在单细胞类型模型,但是双细胞类型模型仍然很普遍。为避免循环推理,作者认为所有基因在两个大脑区域的神经元和非神经元中都能充分表达。同时发生在神经元和非神经元的空间区域性DIE差异(ΔΠ≥0.1)的发生率比偶然预期的要高。这种趋势在兴奋性和抑制性神经元(p≤2.2e-16)以及神经胶质细胞和血管+免疫细胞中也被发现(图3e)。因此,脑区微环境可能会导致HIPP中 EN和IN组之间拼接的相似性不同于PFC 中EN和IN之间的关系。其次,考虑到神经元和神经胶质都是从放射状神经胶质干细胞分化而来,脑区域特异性调节可能掩盖了细胞类型的特异性。

特定脑区域内的细胞类型具有独特的剪接特征

这部分实验作者追踪了单个细胞类型对DIE的贡献。同时,还揭示了所研究脑区的DIE特征,值得进一步探讨每种细胞类型的剪辑指纹(补充图S7)。

脉络丛上皮细胞(CPE)主要通过选择性剪辑转录起始位点(transcriptional starting site, TSS)产生独特的亚型

接下来,作者在HIPP细胞类型的成对比较中进行了DIE检测。在HIPP中,神经元与非神经元比较中发现的DIE最多(图4a),PFC中也已证实了这一点(图S8)。有趣的是,非神经元细胞类型之间的比较显示出比在神经元内观察到的更高的DIE(图4b)。重要的是,涉及CPE的非神经元在比较中具有最高的DIE分数。CPEs负责在脑室中分泌脑膜上皮细胞的脑脊髓液,多种CPEs中的选择性剪辑基因与疾病有关(图4c)。令人惊讶的是,TSS的剪辑(与外显子和polyA 位点相比)在很大程度上解释了CPE细胞的同工型调节(图4d)。此外,与非CPE基因转录本(70/93基因,Bernoulli p = 3×10-7)相比,与CPE相关的转录本往往处于TSS的上游,以便实现CPE特异的转录后修饰、翻译起始和基因表达的转录因子调控(图4e)。

图 4

基于单细胞不同细胞类型的DIE

当在两种细胞类型之间观察到DIE时,两个相互竞争的假设可以解释这种现象。每种细胞类型中所有细胞都能均一地反映两种细胞类型之间同工型表达的差异,或者一种或两种细胞类型的单个细胞在同工型表达中发生变异。如,对于Nnat,室管膜细胞和兴奋性神经元之间的DIE存在于绝大多数的单个细胞。但是,兴奋性神经元和颗粒神经母细胞之间的DIE情况则不同:某些颗粒神经母细胞的细胞行为类似于兴奋性神经元,而另一些则表现为非神经元,这可能是由于颗粒神经母细胞的亚群不同(图4f)。

发育过程中基因亚型的差异表达反映了功能的动态变化

在海马细胞上利用Slingshot技术,研究将放射状神经胶质样细胞(RGL)转分化回了兴奋性神经元。重要的是,在海马的CA1和CA3中,从齿状回(DG)颗粒细胞过渡到更成熟的兴奋性神经元的过程中,许多外显子的插入水平发生了变化(图 5)。

图 5

海马中发育时高表达基因成纤维细胞生长因子13(Fgf13)显示神经元亚型特异性TSS

Fgf13在多个神经元细胞类型和亚型中表现出较高的DIE(ΔΠ> 0.5)。Fgf13在小鼠出生后表达达到峰值,特别是在HIPP中。Fgf13是成纤维细胞生长因子(FGF)超家族的成员,该家族不具有信号序列,不会被分泌到胞外并且仅在细胞内起作用。它在细胞内的作用是调节电压门控钠通道,rRNA转录和微管稳定。在各种Fgf13亚型中,两种具有不同TSS的亚型在大脑发育过程中占主导地位。研究发现Fgf13的选择性剪辑多发生在兴奋性神经元和抑制性神经元(图5f)。下游TSS亚型 Fgf13-S是所有兴奋性类型和未成熟抑制型的主要HIPP亚型。相反,上游TSS亚型Fgf13-VY在DG神经母细胞中部分可见,在抑制性中间神经元类中占主导地位。

与囊泡运输相关的突触基因在发育的海马神经元中显示出差异性剪辑

许多突触基因在发育中的HIPP中低表达。但是,充分表达(> 50个读数)的基因亚型可以区分不同神经元类型。参与胞吞作用的Snap25的两个亚型(Snap25-a,Snap25-b)是由于他们具有两个互斥表达的外显子。与文献一致,研究发现Snap25-b在CA3兴奋性神经元(EN3)的转录本比例高于其在CA1和下丘脑(EN1,EN2)的表达。但是,研究发现在颗粒状兴奋性神经元中具有更高的Snap25-a丰度,而成熟的兴奋性神经元则转变为Snap25-b。有趣的是,中间神经元前体和Cajal–Retzius细胞(IN1,IN3)中的Snap25-b比兴奋性神经元表达更多,提示这两类细胞需要更大的囊泡池(图S11b)。或者,在兴奋性神经元发育之前,中间神经元可以从Snap25-a转换到Snap25-b。

滑动亚型测序(sliso-Seq)描述剪辑变化的空间定位

为了从空间意义上审视本研究的观察结果,实验比较了出生后第8天小鼠的矢状切面10X Genomics Visium空间转录组学数据与单细胞短读长HIPP区的数据,证实了兴奋性神经元在CA区和下丘脑的空间定位(图6a),与PFC数据的比对证实了兴奋性前体存在于不同的皮质层中(图6b)。为了使用正交技术验证基因亚型表达的区域特异性,研究使用长序列测序将复合HIPP和复合PFC单细胞数据之间的ΔΨ值与海马区与皮层的ΔΨ值相关联。基于单细胞数据,重点研究了具有特定区域剪辑模式且没有其他受体/供体的40个外显子。总体而言,研究发现85%的单细胞和空间HIPP/PFC的拼接差异均指向同一方向(伯努利概率<= 3.5e-06)(图6c)。此外,我们证实了Pkm和Clta中的神经发育外显子包含插入开关,其中单细胞数据的非神经外显子和发育相关外显子在DG和空间数据的脉络丛中富集(图6d)。

图 6

总结

总而言之,利用空间转录组学的思路,这些结果提供了跨大脑区域细胞类型的基因全长亚型的详细分布,使我们更接近理解大脑的全面选择性剪辑基因图谱。

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