【科研反套路】肿瘤免疫微环境相关研究的文章

今天要给大家分享的是一篇发表在NC上的肿瘤免疫微环境相关研究的文章:“Tumor derived UBR5 promotes ovarian cancer growth and metastasis through inducing immunosuppressive macrophages”,文章研究发现E3泛素连接酶UBR5能够促进卵巢癌(OC)对肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的募集,同时能够通过细胞因子/趋化因子及β-catenin信号通路促进OC的转移。

研究背景

近年来,肿瘤免疫微环境(TME)的研究已经逐渐成为肿瘤研究的核心部分,特别是单细胞测序技术的发展,使得TME的研究突飞猛进。TME对于认识肿瘤的发生、发展和转移等过程有着重要的意义,对于肿瘤的诊断、防治和预后亦有着重要的作用。那么在不做单细胞的情况下,是否能详细的研究肿瘤免疫微环境呢?答案是肯定的!

与许多主要通过血管系统扩散的上皮性癌症不同,卵巢癌(OC)有从原发肿瘤转移到腹膜腔并植入腹部器官的倾向。在这一过程中,播散的OC细胞聚集并形成球状体,以克服免疫攻击和化疗。因此,球状体的形成是OC转移性扩散的关键步骤,并有助于肿瘤复发。OC的肿瘤微环境(TME)具有高度的免疫抑制作用,使得OC可以逃避免疫监视。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在OC的TME中具有M2免疫抑制表型,这与TAMs促进肿瘤生长、侵袭、血管生成、免疫逃逸和转移的能力有关。因此,靶向调节OC – TAMs相互作用和球状体形成的重要分子可能为更有效地治疗OC提供机会。已有研究表明E3泛素连接酶UBR5在多种癌症类型中高表达,与肿瘤的疾病进展密切相关,然而其在OC中的作用机制尚不明确。

研究内容

1.敲减UBR5抑制卵巢癌生长

文章的研究目的是探究E3泛素连接酶UBR5参与调控OC生长和转移的作用机制。为此,在通过TCGA数据分析确定UBR5在OC中高表达之后,研究人员对小鼠OC细胞ID8中的Ubr5进行了敲减处理,并从体外和体内两个层面分析了小鼠同源Ubr5基因对OC疾病进展的影响,确定敲减Ubr5能够破坏ID8细胞的MET(间质上皮转换)和肿瘤在肺中的定植,减少肿瘤的肝转移和肺转移(这里我们可以看到体外细胞表型实验和体内成瘤实验用到的都是小鼠OC细胞,进行的基因敲减处理同样是针对人UBR5的小鼠Ubr5基因,这种做法可有效降低物种异质性引起的实验偏差)

2.敲减UBR5改变卵巢癌小鼠免疫微环境

已知浸润于肿瘤微环境(TME)的免疫细胞被肿瘤细胞所利用以促进肿瘤的生长和转移。为了解UBR5对TME中各类免疫细胞的影响,研究人员对Ubr5敲减小鼠(ID8/Ubr5−/−)腹腔中的免疫细胞组成进行了分析,发现肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)含量显著降低,同时分析发现小鼠腹腔中球状体(spheroids)的数量和大小均随着Ubr5的消失而减少。上述结果表明UBR5ID8/Ubr5/小鼠TMETAMs的招募中起重要作用(研究人员在确定UBR5调控肿瘤细胞转移的情况下,并不局限于肿瘤细胞中转移机制的研究,而是跳出限定,从更高的层面分析肿瘤细胞UBR5表达变化对肿瘤免疫微环境的变化,这一点非常值得大家借鉴)

3.TAMsUBR5调控的OC生长和球状体形成中的作用

那么敲减UBR5后,小鼠(ID8/Ubr5−/−)的肿瘤生长转移被抑制是否与TME中巨噬细胞的减少有关?为此,研究人员将对照卵巢癌小鼠(ID8/GFP)中分离获得的TAMs注射入ID8/Ubr5−/−小鼠体内,分析发现肿瘤生长、腹水积聚和球状体形成能力均显著提高,小鼠的生存期显著缩短。而进一步分析发现相对于ID8/Ubr5−/−小鼠,利用氯磷酸二钠脂质体(LC)处理的ID8/GFP小鼠(LC可清除腹腔巨噬细胞,但不影响T细胞积累),肿瘤负荷更高,球状体大量堆积,小鼠生存期缩短。上述实验结果表明TAMs之外,还有其他因素参与UBR5调控的肿瘤促进活动

4.TAMsUBR5缺陷肿瘤中免疫抑制特性改变

为什么敲减UBR5后,肿瘤对巨噬细胞的招募会减少呢?研究人员通过Transwell实验分析发现UBR5缺失可能通过旁分泌的方式减少肿瘤对巨噬细胞的招募(具体方法为分析经ID8/Ubr5−/−肿瘤细胞上清液处理后的巨噬细胞迁移能力)

卵巢癌肿瘤微环境中TAMs主要表现为M2型,以促进肿瘤的生长和转移。为了解敲减UBR5后,TAMs表型是否发生改变,研究人员对ID8/Ubr5−/−小鼠的TAMs表型相关基因进行分析,发现M1表型标志基因(il12a、Ccr2)表达显著上调,M2表型标志基因(Cx3cr1,il10)表达下调,且研究发现在敲减UBR5后,Cx3cr1表达被完全抑制。进一步分析发现ID8/Ubr5−/−荷瘤小鼠的TAMs表现出更弱的T细胞增殖抑制活性。上述结果表明UBR5不仅以旁分泌的方式影响TME招募TAMs,还影响TAMs的免疫抑制活性

5.敲减UBR5引起肿瘤球状形成障碍

研究人员发现敲减UBR5的ID8细胞在单独及与TAMs共培养的3D球状体培养中扩张速度都较慢,同时分析发现ID8/Ubr5−/−小鼠的TAMs与对照组小鼠促进球状体形成的能力相似,表明UBR5可能以独立于TAMs的细胞内方式调节OC球状体形成。为此,研究人员基于已报道的肿瘤中UBR5调控机制展开了分析,发现UBR5并非通过细胞凋亡机制而是通过p53调控β-catenin信号通路进而影响球状体的形成

6.UBR5缺乏导致的细胞因子/趋化因子生成受损

为阐明UBR5旁分泌调控TAMs的具体机制,研究人员对ID8/Ubr5−/−小鼠的腹膜细胞进行了RNA-seq分析,发现TME中参与巨噬细胞招募的基因(Ccl2、Vegf、Il6、Csf-1和Cxcl1)表达显著下调,同时分析发现Wnt信号通路相关基因表达下调。β-catenin是一种富集于OC球状体的癌症干细胞标记物,β-catenin的激活可调节球状体的形成。为了解旁分泌因子CCL2、M-CSF和β-catenin在巨噬细胞活化和肿瘤发生中的作用,研究人员对ID8/Ubr5−/−细胞中的这三个分子进行了过表达分析,发现细胞恢复其生成球状体、招募巨噬细胞和形成菌落的能力。上述结果表明旁分泌因子(CCL2/M-CSF)和细胞内β-catenin信号通路有助于UBR5介导的OC疾病进展

7.UBR5对人卵巢癌生长和巨噬细胞招募的需求

上述对于UBR5影响OC疾病进展的调控机制研究均是基于小鼠OC细胞及小鼠OC细胞构建的小鼠模型。为确定人卵巢癌细胞中UBR5同样行使该调控机制,研究人员首先利用IHC分析发现OC患者原发肿瘤中UBR5表达与巨噬细胞浸润和细胞增殖呈正相关。随后体外细胞表型实验和体内成瘤实验均表明UBR5在人OC细胞中的调控机制与小鼠相似(OC中完整的UBR5调控机制已在小鼠中进行了相应的实验分析及阐述,但研究的出发点和归属都是人OC的研究,因此我们需要确定人中UBR5的调控机制是否同小鼠一致,这也是后期临床研究的重要基础)

8.通过靶向UBR5增强OC治疗效果

研究的最后就需要理论联系实际了,即UBR5作为OC疾病进展的关键分子是否可以作为OC治疗的靶点。为此,研究人员通过体内和体外实验分析了UBR5对于化疗耐药的硬性,同时分析了UBR5靶向抑制与特异性CAR-T细胞治疗之间的协同作用,证明靶向OC来源的UBR5可以缓解化疗耐药,与免疫治疗协同治疗可以大大提高OC的疗效

文章点评

我们经常会说NC上的文章有些水,但这篇文章通读下来不难发现文章研究思路严谨,实验设计环环相扣,兼顾每一环节的各个方面。对于一个肿瘤相关的目标分子 UBR5,我们常规的肿瘤研究思路很可能是对其上下游调控机制进行分析,阐明其在疾病进展中的功能作用。然而作者并没有单纯的研究UBR5高表达的具体机制,对于UBR5的下游调控机制也并非常规的肿瘤细胞的增殖、迁移和转移的表型研究,而是从肿瘤免疫微环境中免疫细胞组分的变化及肿瘤球状体形成的这两个角度出发,详细阐明UBR5调控OC疾病进展的具体机制,可谓十分新颖,非常值得我们学习借鉴。

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