【科研反套路】摒弃ceRNA机制 研究编码蛋白的circRNA思路

CircRNA是近年来功能性非编码RNA研究领域的新宠。CircRNA研究的一般思路是ceRNA机制,研究思路及研究方法目前已完全套路化,实验的完整度悄然成为了ceRNA研究文章影响因子的主要因素。现今完成全套实验的ceRNA研究文章可以发到15分(指路Molecular Cancer),那么如果想要发表更高分的circRNA研究文章,该往哪个思路出发呢?

今天要给大家分享的是今年3月份发表在Nature Cell Biology(IF=20.042)的一篇研究具有蛋白编码能力的circRNA文章“Circular RNA-encoded oncogenic E-cadherin variant promotes glioblastoma tumorigenicity through activation of EGFR-STAT3 signalling”,文章研究发现胶质母细胞瘤中高表达的circRNA circ-E-Cad通过编码为C-E-Cad蛋白参与调控进展。

研究背景

胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)是一种常见的恶性脑部肿瘤,预后较差,其血脑屏障和瘤内高度异质性严重限制了目前GBM治疗的效果。EGFR扩增或突变是公认的原发性GBM肿瘤发生驱动因素,然而针对EGFR的靶向治疗效果一直不佳。

环状RNA(circRNAs)是具有共价闭合结构的RNA转录本,通常认为没有编码能力。然而近年来已有研究表明部分circRNA具有开放阅读框(ORFs),可以通过编码蛋白行使功能调控作用。本文的目的就是揭示具有编码能力的circRNA在GBM中调控作用。

研究思路

研究内容

1. Circ-E-cadGBM中选择性表达

为确定与GBM疾病进展相关可编码蛋白的circRNA,研究人员首先利用circRNA-seq结合Ribo-seq以及circBase数据库信息筛选出10个候选的具有编码能力的差异circRNA,随后检测各circRNA在GBM组织及胶质瘤干细胞(GSCs)中的表达量,确定来源于线性E-Cadherin(CDH1)的circRNA circ-E-CadGBM中特异性高表达(Ribo-seq:检测被核糖体保护的正在进行翻译的mRNA片段。小编建议如果没有条件做Ribo-seq,可以忽略掉,直接对筛选的目标circRNA进行编码能力的分析,效果是差不多)

紧接着研究人员对circ-E-Cad的circRNA特性进行了分析,主要包括成环验证(剪接位点分析)、稳定性分析(核酸酶处理)以及亚细胞定位分析(FISH实验)。

2. Circ-E-Cad 编码254个氨基酸的蛋白C-E-Cad

Ribo-seq检测到circ-E-Cad的剪接位点,于是研究人员对circ-E-Cad的编码能力进行了分析,发现其潜在的内部核糖体进入位点(IRES)能够驱动circ-E-Cad的开放阅读框(ORF)进行跨剪接位点的多轮翻译,编码末端含14个特异性氨基酸(14-aa)的蛋白C-E-Cad

进一步分析发现C-E-CadGSCsGBM中均显著高表达,而在正常组织(NB)中不表达。生存分析结果显示C-E-Cad高表达患者预后差,而E-cadherin表达量与患者预后无关,同时分析发现circ-E-Cad和C-E-Cad与干细胞标志物SOX-2的表达正相关,提示其与GSCs干性维持相关。

3. C-E-Cad调控GSCs的生物学特性和致瘤性

前两步分析已经确定GBM中差异表达的circ-E-Cad能够编码C-E-Cad,那么其是否通过C-E-Cad调控GBM的疾病进展?于是研究人员对C-E-Cad进行了敲减(针对剪接位点的shRNA)和过表达处理,通过体内和体外实验分析确定高表达C-E-Cad能够促进GSCs的增殖、侵袭和抗凋亡,提高GSCs干性,促进颅内肿瘤的生长(值得注意的是研究人员在对C-E-Cad进行敲减处理时,额外采用CRISPR-Cas9技术对circ-E-Cad来源线性序列中的ALU序列进行了敲除(ALU序列是circRNA形成的关键序列),从根源上阻止了circ-E-Cad的形成及C-E-Cad的产生)

4. C-E-Cad激活GSCs中的STAT3PI3K-AKTMAPK-ERK信号通路

那么C-E-Cad影响GBM疾病进展的具体机制是怎样的?为此,研究人员对敲减circ-E-Cad后的GSCs细胞进行了RNA-seq分析,发现STAT3、PI3K-AKT和MAPK信号通路被显著富集。同时GSEA分析发现STAT3与C-E-Cad表达显著正相关,进一步分析发现C-E-Cad参与调控GSCs增殖与存活相关分子p-STAT3p-AKTp-ERK1/2的表达

已有研究表明线性E-cadherin参与调控肿瘤疾病进展。为此,研究人员分析了GBM中E-Cadherin的功能作用,具体实验为敲减GSCs中的CDH1,随后过表达C-E-Cad或E-cadherin进行功能回复,分析发现E-cadherin对GSCs的生物学行为没有明显影响,而C-E-Cad能够增强GSCs的干性,提示GBM中是C-E-Cad而非E-Cadherin调控GBM疾病进展

5. C-E-Cad是一种能激活EGFR的分泌蛋白

上述研究已经表明C-E-Cad能够影响STAT3、PI3K-AKT和MAPK的磷酸化水平,但具体是如何调控的有待进一步探究。研究人员首先对C-E-Cad蛋白特性进行了分析,确定C-E-Cad是可溶性的分泌蛋白。随后研究人员分离纯化His-tagged C-E-Cad(His-tag:在蛋白质的N末端或C末端人为标记上连续6个组氨酸,使其能特异性的被对应的抗体识别,有利于进行纯化或免疫学实验),通过特异性抗体实验进一步证实C-E-Cad参与调控GSCs的增殖、侵袭等。

已有研究表明受体酪氨酸激酶(RTKs)通常在GBM中高表达。因此,研究人员对C-E-Cad调控的RTKs进行了分析,发现相对于其他RTKs,EGFR显著影响C-E-Cad对p-STAT3、p-AKT和p-ERK1/2的激活。对EGFR进行突变处理分析,进一步表明C-E-Cad通过活化EGFR调控下游STAT3PI3K-AKTMAPK信号通路

6. C-E-CadC端作用于EGFRCR2

接下来就需要确定C-E-Cad活化EGFR的具体方式,研究人员通过IP(免疫沉淀)、IB(免疫印迹)和IF(免疫荧光)等实验证实C-E-Cad和EGFR之间存在蛋白互作。随后,通过分别对C-E-Cad和EGFR进行相应的突变处理,分析确定C-E-CadC末端非14-aa区域能够与EGFRCR2结构域相互作用(PS:C-E-Cad的氨基酸尾包含特异性的14-aa,但是这里研究发现与EGFR结合的区域并非是这14-aa,而是C末端的其他区域,这说明14-aa尾可能仅是C-E-Cad的标记区段,而非功能区段)。

(对于蛋白互作,这一块用到了比较新的技术,包括利用ClusPro sever分析蛋白3D模型之间的互作关系及通过表面等离子体共振(SPR)分析两者结合能力)

7. C-E-Cad可以独立激活EGFR

EGFR是表皮生长因子受体,通常情况其通过与表皮生长因子(EGF)互作行使相应的调控功能,已有研究表明EGF与EGFR的L1和L3结构域互作。为此,研究人员分析了EGF、C-E-Cad与EGFR的结合竞争关系,分析发现两者对EGFR的活化存在协同效应,且C-E-CadEGFR的活化作用更强,且能单独活化EGFR

与此同时,研究人员分析了GBM中同样高表达,且通常与EGFR协同表达的EGFR III型突变体(EGFRvIII)与C-E-Cad之间的调控关系,分析发现C-E-Cad对EGFRvIII的活化作用与EGFR相同。(看到这,不得不感叹作者的实验设计非常严谨,把所有的可能性都进行了充分考虑,看似偏离研究主线,实则让主线更为立体)

8. 靶向C-E-Cad增强抗EGFR治疗的治疗效果

肿瘤相关研究的最后通常是回归临床研究。以往针对GBM的EGFR靶向治疗效果一直不佳,为此,研究人员对靶向EGFR上游调控分子C-E-Cad的治疗效果进行了分析,发现利用C-E-Cad抗体协同EGFR抑制剂能够显著增强GBM患者的治疗效果。

文章点评

近年来,circRNA研究热度非常高,发表的ceRNA研究文章更是呈爆炸式增长,其中国人发文占比相当高,究其原因无非是ceRNA研究思路简单好复制,实验难度较低,实验量限制性小。然而近两年多家杂志对这种套路化、复制型的ceRNA研究认可度降低,文章接收率急剧下降。那么这种情况下,我们应该怎么去应对呢,特别是前期为了快速发表ceRNA研究文章,花大价钱做了circRNA测序的,那么今天发表的这篇文章就是很好的例子,能够让你充分利用circRNA测序数据的同时,摒弃老套的ceRNA机制,从circRNA编码蛋白的角度出发,冲撞出不一样的circRNA研究火花。

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