【科技前沿】Cancers:神经科学与肿瘤生物学

研究前沿

多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme)是一种严重的IV级致命脑肿瘤,患者的中位生存期为14个月。尽管可以通过手术切除以及同时进行的化学疗法和放射疗法,但是目前仍缺乏治疗GBM的有效手段。因此,探索新的治疗GBM途径至关重要。脑肿瘤细胞被发现具有电活性,这是因为细胞中表达了离子通道,这一特性为我们提供了治疗GBM的新方向。离子通道是细胞膜中一类特殊的蛋白质,可以使带正电和带负电的离子流出或流入细胞,从而控制膜电位。膜电位是正常细胞和癌细胞中至关中重要的生物物理信号。研究发现,特定种类的离子通道不仅能使细胞的细胞周期发生改变,从而促进细胞的生长和增殖,而且它们在脑肿瘤的发展中也可能是必不可少的。抑制钠,钾,钙和氯离子通道被发现可减少胶质母细胞瘤细胞生长和侵袭的能力。因此,离子通道抑制剂的有效开发利用可能成为神经胶质瘤治疗新途径的关键

英国诺丁汉大学儿童脑瘤研究中心的Stuart Smith团队在国际信号传导学会(Signal Transduction Society, STS)会刊Cancers(IF:6.126)发表重磅综述文章“Ion Channels as Therapeutic Targets in High Grade Gliomas”,系统性地探讨了离子通道在神经胶质瘤发生中的作用,靶向和利用这些通道以提供新治疗靶标的可能性。为开发以离子通道为靶标的抗肿瘤药物提供了前言参考依据[1]

脑胶质瘤

GBM的全球发病率是每100,000人口中有10人,尽管诊断数据表明GBM多发于45至75岁之间,但该疾病的发病年龄却覆盖全年龄段 原发性GBM占所有患者95%,而原发性较少的恶性神经胶质瘤(继发性的,通常具有IDH突变)占剩下的5%。目前还缺乏GBM的有效治疗手段,通过外科手术神经胶质瘤进行组织学诊断仍是金标准 尽管如此,由于GBM细胞的侵袭性,很少能做到完全切除。具有浸润性的肿瘤细胞一旦进入邻近脑组织内,便会导致肿瘤再生。手术后同时进行烷基化化疗(替莫唑胺)和电离辐射是现有广泛应用的GBM治疗方法,但确通常对该病的进程影响十分有限

离子通道

离子的跨膜运输是维持正常细胞功能和活性的基本过程。离子通道细胞周期,细胞死亡,细胞体积调节和增殖能力等对于细胞存活至关重要的活动有重要调节作用,并且可能是从使细胞从正常状态恶性状态转变为的一个关键因素

 

离子通道的膜电位

离子通道和转运蛋白在产生细胞膜电位(Vm)方面中起主要作用。离子通道作为选择性渗透的孔隙,控制离子根据化学和电梯度]穿过细胞膜。 静息状态细胞的Vm为负;当膜电位移动到一个更负的状态时,该细胞被超极化Hyperpolarization);而当Vm向与超极化相反的方向移动时,该细胞被去极化Depolarization)

细胞周期与离子通道

众所周知,细胞周期控制着细胞的增殖能力。越来越多的数据表明,离子通道的膜电位在细胞周期活动中起着重要的作用。

在与癌症相关的基因中,编码离子通道的基因具有突出的地位。细胞内离子稳态的失调是许多病理和生理事件的标志。因此,离子通道的异常表达被认为是癌症发生和发展的重要标志物之一。

Cone及其同事通过一系列开创性的实验首次确定了离子通道在癌症中的作用。他们观察到肉瘤细胞进入M期之前经历了超极化,这表明膜电位可能在细胞周期进程中发挥关键作用[2]。为了巩固这一证据,之后的研究显示,超极化可逆地阻断有丝分裂和随后的DNA合成。根据这些数据,可以推测细胞的Vm与其分化状态相关。例如,上皮细胞等终末分化细胞具有超极化的Vm。这些研究表明,具有高度可塑性未分化细胞(如肿瘤细胞和胚胎干细胞)保持在去极化状态,而已分化的细胞则倾向于超极化状态。

在正常细胞向恶性肿瘤细胞的转化过程中,Vm有明显的去极化趋势。在许多体内和体外研究中,例如正常乳腺细胞和乳腺癌细胞,癌细胞倾相比于正常组织细胞更去极化。如前所述,离子交换过程对细胞的增殖活性,细胞凋亡和迁移有调控作用。离子通道与细胞凋亡之间具有广泛的联系。如,钙通道调节被发现与细胞的凋亡途径有关。细胞质Ca2+浓度超载时会通过不同途径触发细胞的凋亡。同时,Ca2 +水平升高也会促进线粒体对Ca2 +的吸收,从而打开线粒体通透性转换孔(MPTP)并触发细胞凋亡。

脑胶质瘤中的离子通道

1. 胶质瘤细胞侵袭转移中离子通道的作用

胶质瘤细胞似乎具有特定的侵袭能力,并能适应空间限制。细长的纺锤状形态有助于胶质瘤细胞侵入周围大脑组织。

这种形态上的变化依赖于细胞的收缩能力,是由Cl和K+介导的水流出调节机制。在细胞凋亡期间,细胞会经历收缩。在正常细胞和恶性细胞中,细胞体积和形态调节的改变均与细胞凋亡有关。研究表明,通道的下调表达与癌细胞逃避凋亡的能力有关。胶质瘤细胞在发生体积变化是由配体诱导的离子通道激活引发的,是一种协同级联反应。当水分子与Cl和K+离子一起运动会促进细胞形态学上的改变,致使神经胶质瘤细胞成功地在狭窄的大脑环境中发生迁移并浸润到不同部位。表1总结了一些离子通道在神经胶质瘤中的具体作用。下面将简述主要类型离子通道在GBM中的调控功能:

2. 钠通道

 2.1 上皮钠通道(ENaC)

上皮钠通道(ENaC)是一类对阿米洛利敏感的钠通道,与多种癌细胞的持续增殖和侵袭有关。PcTX-1和苯扎米尔是阿米洛利的结构类似物,可阻断ENaC通道的功能。当细胞培养物中加入这些抑制剂时,D-54-MG胶质瘤细胞在G0/G1期出现细胞周期停滞,并减少了S和G2/M期的积累,这表明钠离子的细胞内流对神经胶质瘤细胞的细胞周期进程至关重要。在基因表达分析中,GBM患者样品中的钠通道被上调。在对21个GBM的临床标本分析中发现,有90%的离子通道基因至少有一个突变,而钠通道的突变多是错义突变。与ENaC没有突变的GBM患者(689天)相比,体内ENaC发生突变的患者与生存期较短(168天)。有趣的是,具有IDH1突变的患者没有发生任何ENaC突变。此外,当以ATPase抑制剂(地高辛)处理细胞时,与星形胶质细胞相比,对U-87 GBM细胞更具毒性[3]。

 2.2. 电压门控钠通道

电压门控钠通道(VGSC)α亚基家族包含9个成员Nav1.1–Nav1.9,由基因SCN1A–SCN11A编码,α亚基被发现在神经胶质瘤中表达。进一步的测序研究表明,SCN8A在大量肿瘤样品中高度富集,而siRNA敲除SCN8A钠通道基因可降低胶质瘤干细胞样细胞(GSC)的活力(降低55-62%的增殖能力)。对人类神经胶质瘤活组织的研究发现,神经胶质瘤的严重程度与VGSC亚型的表达表达水平呈负相关。Nav1.6是在CNS中发现的最丰富VGSC亚型,但是在肿瘤的活检组织中却几乎完全检测不到。

3. 钾通道

K+通道是一类跨膜蛋白,控制细胞选择性地K+流出。静息状态的细胞具有独特的离子流向,其中大多是K+离子流向细胞外空间。K+离子的这种持续流出会产生负的膜电位[79]。目前已有许多研究探索了不同钾通道亚型在肿瘤发展中的作用。

 3.1 内向整流钾通道 (Kir)

内向整流钾通道4.1(Kir4.1)的表达与星形胶质细胞的分化有关。Kir4.1通过调节膜电位在<0 mV水平,使细胞退出细胞周期,调节星形胶质细胞的增殖。在Kir4.1缺失的神经胶质瘤细胞中,过表达Kir4.1会导致细胞周期从G2 / M期转移到G0 / G1静止期,对细胞的生长产生损伤;当用BaCl2抑制Kir4.1通道时,这些作用却可以完全逆转[4]。这项研究表明Kir4.1可诱导细胞生长和成熟的细胞膜超极化。

 3.2电压门控钾通道 (Kv)

电压门控钾离子通道(Kv)是最大的离子通道家族。已有大量文献报道,Kv通道通过促进细胞周期的进程在细胞增殖中具有重要作用[81]。在许多癌症类型中,Kv通道的表达都发生了改变,参与了肿瘤的发展。一项来自TGCA,Rembrandt和CGGA数据集的研究确定了三个钾通道基因KCNN4,KCNB1和KCNJ10在肿瘤的恶性进展中起着重要作用,并与小儿GBM(pGBM)的整体存活率相关。在研究中的样本中,KCNN4的表达上调,而KCNB1和KCNJ10的表达则下调。根据这一遗传特征,研究将患者分为高风险(三个基因均表达)和低风险(三个基因均不签名)。研究结果表明,被鉴定为预后不良的“高风险pGBM患者组对化疗的敏感性增加[5]。

人类ether-a-go-go相关基因(hERG)编码K+通道家族中的Kv11.1亚型。癌细胞通常表现出去极化的膜电位,据推测hEAG具有控制膜电位的能力。hERG通道与神经胶质瘤有关,在GBM中发现了hEAG1和hERG1的差异表达,后者赋予了肿瘤的恶性状态和性质。同样, siRNA干扰实验表明,hERG介导的神经胶质瘤细胞系凋亡,显示出该通道在神经胶质瘤凋亡中的关键作用[6]。

 3.3 钙激活钾通道(BK)

BK通道是一类独特的电压依赖性大电导Ca2+激活的K+通道,在电化学信号传导中起重要作用。胶质瘤细胞中的BK通道有它们自己的特定亚类-胶质瘤BK通道(gBK),其特征是对细胞内Ca2+的敏感性增强。这些BK通道在神经胶质瘤组织中上调,其表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关。伊贝毒素(ibTX)是BK通道的特异性药理抑制剂,生存率测定中显示,ibTX可剂量/时间依赖性地导致神经胶质瘤细胞数量减少。此外,通过ibTX抑制BK通道可导致人恶性神经胶质瘤细胞在S期停滞和细胞死亡,从而证明了gBK通道在神经胶质瘤细胞周期进程中的作用[7]。

4. 氯通道

氯通道是功能和结构上最具多样化的一类离子选择性通道,与心脏、神经元和平滑肌细胞的细胞体积调节和兴奋性有关。 由于氯通道与细胞体积调节的关系,它们是抑制癌细胞运动的有效靶标。ClC-2和ClC-3经鉴定是在神经胶质瘤细胞膜中特异性上调的Cl通道。这些通道的表达增加使神经胶质瘤细胞具有Cl转运的增强途径,反过来促进有丝分裂和侵袭过程中细胞形的状和大小变化[8]。

5. 钙通道

 5.1 T型钙通道

T型Ca2+通道是癌细胞周期和生存的关键调节因子。T型Ca2+通道α亚基Cav3.2在GBM原代细胞和小鼠异种移植物中均能促进细胞增殖和去分化。GBM小鼠中异种移植的体内研究表明,四氢萘酚衍生物(T型Ca2+通道阻滞剂)可以显著减缓肿瘤的进展。同样,shRNA干扰Cav3.1在 GBM中的表达则导致细胞凋亡,使肿瘤大小减小。siRNA敲降T型Ca2+通道Cav3.1和Cav3.2可降低细胞活性和增殖潜力,并诱导U251和U87胶质瘤细胞的凋亡。

6. 瞬时电位阳离子(TRPC通道

TRPC1的表达可促进神经胶质瘤细胞的有丝分裂、细胞增殖和运动活性。在高严重等级的胶质瘤(HGG)中,通过药理抑制剂(例如SKF96365和MRS1845或siRNA)抑制TRPC1的活性会降低细胞的增殖能力并阻止细胞进入细胞周期。有趣的是,当受表皮生长因子(EGF)刺激时,TRPC1会迁移至具有侵袭能力胶质瘤细胞(D54MG)的前沿,这表明生长因子介导了TRPC1在癌细胞迁移中的作用[9]。此外,在肺癌细胞系中,通过siRNA抑制TRPC1可以显著减缓细胞周期在G0/G1处细胞的生长[10]。

离子通道抑制剂作为临床治疗的靶点

离子通道是治疗多种疾病的药物靶标。它们的特别诱人之处是作为潜在抗癌药物,因为抑制这些通道的分子是从细胞外空间发挥作用,并且不一定需要进入细胞。大量研究证实离子通道阻滞剂对癌细胞进程和侵袭的具有抑制作用。尽管如此,迄今为止的多数研究还仅仅局限于细胞系水平,尚未找到一种将离子通道的阻滞剂可以作为癌症的临床治疗。当涉及离子通道抑制剂的临床使用时,与这些药物相关的潜在毒性,尤其是对心脏和神经系统的潜在毒性,往往令临床药物研究者们望而却步另一方面,寻找克服血脑屏障以靶向肿瘤也是离子通道作为药物靶点不可避免的话题所以,也可以从已有的一些药物分子中筛选以离子通道为靶标的抗癌药物。2总结了一些可商购的离子通道抑制剂及其对患者和细胞系的治疗/实验作用。

离子通道为靶标的GBM治疗药物试验进展

最近完成了一项米贝拉地尔mibefradi, 一种T型钙通道拮抗剂)与放射线结合I期药物扩展试验,该试验旨在确定药物使用时GBM患者的最大耐受剂量。患者接受米贝拉地尔,剂量从150毫克/天起逐步增加,并且在用药的两周,进行5次放疗,每次放疗剂量为600 cGy,然后进行肿瘤切除手术。一名患者的影像学显示肿瘤完全被切除,有趣的是,在2GBM患者肿瘤组织中检测到了微摩尔水平的米贝地尔。该研究表明,在切除的脑肿瘤组织中可达到药物的药理学有效浓度。还有一项利用丙戊酸盐(VPA,一种钠通道阻断剂治疗确诊的GBM2期试验患者的中位生存期14.2个月延长至29.6个月,且副作用极低[160]值得关注的是,目前VPA进行着另一项多中心II期试验,即丙戊酸抑制剂II与替莫达和放疗联合用于严重胶质瘤患者。但是,针对特定肿瘤特征的其他研究可能对靶向代谢脆弱性有益[161]。目前,研究正在招募一项针对低剂量替莫唑胺TMZ,一种T型钙通道拮抗剂)+二甲双胍联合化疗与低剂量替莫唑胺+安慰剂联合治疗复发性或难治性胶质母细胞瘤的疗效和安全性的随机干预II期临床试验(NCT03243851)。

离子通道为靶标的抗肿瘤药物开发若干问题

尽管离子通道调节剂在离体的病理生理环境中对肿瘤细胞系有作用,但这些药物仍未在临床用于治疗癌症。 越来越多的研究和大量的体外证据表明,将这些离子通道调节剂与主流癌症疗法联合使用可能对癌症的治疗有效,但是迫切需要进一步的体外和机制分析[39,102]。另外一个值得注意的问题是,离子通道在多种细胞和组织类型中普遍表达,因此主要关注点在于使用这些抑制剂的潜在全身反应[102]。例如,心脏细胞高水平表达各种类型的离子通道,但是由于心脏毒性,许多靶向离子通道的药物已从临床试验中撤出。发现低组织毒性的离子通道可变剪接变体和亚基,以及采用局部药物递送系统可能是开发特定肿瘤抑制剂的关键。

参考文献:

1. Griffin, M., et al., Ion Channels as Therapeutic Targets in High Grade Gliomas. Cancers (Basel), 2020. 12(10).

2. Cone, C.D., Jr., Electroosmotic interactions accompanying mitosis initation in sarcoma cells in vitro. Trans N Y Acad Sci, 1969. 31(4): p. 404-27.

3. Joshi, A.D., et al., Sodium ion channel mutations in glioblastoma patients correlate with shorter survival. Mol Cancer, 2011. 10: p. 17.

4. Higashimori, H. and H. Sontheimer, Role of Kir4.1 channels in growth control of glia. Glia, 2007. 55(16): p. 1668-79.

5. Wang, H.Y., et al., A three ion channel genes-based signature predicts prognosis of primary glioblastoma patients and reveals a chemotherapy sensitive subtype. Oncotarget, 2016. 7(46): p. 74895-74903.

6. Staudacher, I., et al., HERG K+ channel-dependent apoptosis and cell cycle arrest in human glioblastoma cells. PLoS One, 2014. 9(2): p. e88164.

7. Weaver, A.K., X. Liu, and H. Sontheimer, Role for calcium-activated potassium channels (BK) in growth control of human malignant glioma cells. J Neurosci Res, 2004. 78(2): p. 224-34.

8. Olsen, M.L., et al., Expression of voltage-gated chloride channels in human glioma cells. J Neurosci, 2003. 23(13): p. 5572-82.

9. Bomben, V.C., et al., Transient receptor potential canonical channels are essential for chemotactic migration of human malignant gliomas. J Cell Physiol, 2011. 226(7): p. 1879-88.

10. Tajeddine, N. and P. Gailly, TRPC1 protein channel is major regulator of epidermal growth factor receptor signaling. J Biol Chem, 2012. 287(20): p. 16146-57.

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