【技巧分享】原代骨髓来源的巨噬细胞提取与诱导

最近实验室萌新师妹问我,为啥总是提取小鼠骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages, BMDM)做实验而不用更方便的RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)细胞株?今天我就来介绍一下BMDM细胞在我们实验中的优缺点以及提取和诱导方式。满满都是干货,建议码住后细细品味哦!

BMDM细胞的优缺点十分明显,它最大的优点在于它是原代细胞,其性状和功能更贴近与小鼠机体本身的巨噬细胞,被广大研究人员充分肯定并接受[1]。其次每次试验先用现提,避免了实验室祖传细胞株培养变异的情况,试验结果稳定可靠。正所谓事情往往都具有两面性,这些优点同样也成为了BMDM应用的缺点原代细胞提取过程相对繁琐,操作有一定的难度,每次现提先用实在是麻烦,而且它还得诱导七天才能用,实验周期那么长,你说气不气人!但是,师兄我也是有苦难言啊,近期热到发烫的细胞焦亡可不得用这个巨噬细胞嘛[2],RAW264.7细胞株不含ACS结构域[3](细胞焦亡分子机制中重要的结构之一),所以并不能用于细胞焦亡以及炎性小体的研究。另外强烈建议研究巨噬细胞极化的小伙伴们也尽量运用BMDM细胞。

话不多说,接下来附上BMDM细胞的提取和诱导方法。

 

实验所需的动物、试剂和相关器械

实验动物:6-8周龄C57BL/J小鼠
试剂:M-CSF(商品化的诱导因子)或L929细胞系、含10%FBS DMEM高糖培养基、75%乙醇、无菌PBS。
实验器械:1mL注射器、剪刀、镊子、70μm细胞滤器、15ml离心管、T25细胞培养瓶或细胞培养板。

实验的具体流程

1. 细胞因子M-CSF的获取
M-CSF是一种诱导骨髓细胞向巨噬细胞分化的细胞因子,获取的途径有两种:
1)找商业化的细胞因子产品直接购买,M-CSF的使用浓度在20-50ng/mL,不同品牌有所区别。
2)自己培养能够分泌这种细胞因子的细胞——L929细胞。L929细胞种植在直径150mm的大皿中,第二天弃掉旧的培养基,PBS清洗3次后更换为新的培养基,放置在培养箱培养5-7天后收集培养基,将培养基1200rpm/min离心5min,取上清分装保存于-20℃待用,诱导骨髓巨噬细胞分化的培养基为含有15% L929培养基的DMEM高糖培养基。


2. 骨髓巨噬细胞的分离
1)小鼠取腿骨

小鼠麻醉后脱臼处死,将小鼠放置在盛有足量75%乙醇的烧杯中浸泡消毒5min,将浸泡好的动物用纸吸去多余的酒精。用剪刀在小鼠背部剪开一小口,用手直接撕开皮肤至小鼠小腿关节处,去除小鼠足关节以及皮肤(此过程略显粗暴血腥,但效率很高)。用剪刀沿着小鼠大腿根部大转子后肢拆(拆不是折哦,千万不要将腿骨折断了)下来去掉肌肉组织后放置在含有75%乙醇的培养皿内浸泡5min,更换新的75%乙醇的培养皿移入超净台中。

2)BMDM细胞提取和诱导

将乙醇浸泡的腿骨移入冷的PBS浸泡,洗去胫骨、股骨表面的乙醇,此过程可重复3次。将清洗好的股骨、胫骨分开,并用剪刀分别将股骨、胫骨两端剪断,使用1mL注射器吸取冷的诱导培养基将骨髓从股骨、胫骨中吹出,反复吹洗3次,直至腿骨内看不到明显的红色为止。用5mL移液枪将含有骨髓细胞的培养基反复吹打,使细胞团块分散,然后使用70μm细胞滤器将细胞过筛,转移至15mL离心管内,1500rpm/min离心5min,弃上清,加入红细胞裂解液重悬静置5min后1500rpm/min离心5min,弃上清用冷的配置好的骨髓巨噬细胞诱导培养基重悬铺板。细胞培养期间不更换培养基,培养第三天后更换一半骨髓巨噬细胞诱导培养基,第五天更换全部培养基,第七天即可用于后续实验。

图:诱导成熟的BMDM细胞形态

实验心得与经验分享

BMDM细胞不可传代,不可用胰酶消化,使用时可用细胞刮直接刮下来。建议直接铺板用于后续实验,更换培养容器会损伤细胞。细胞诱导成功后要及时使用,不易长时间培养,会恢复原来的圆形形态。

好了,以上就是我介绍的BMDM细胞提取和诱导的方式,祝大家科研顺利咯!

注:文章图片来自于实验室美丽的师姐,已取得知情同意!禁止他人使用!

参考文献

[1] Starkey Lewis Philip,Campana Lara,Aleksieva Niya et al. Alternatively activated macrophages promote resolution of necrosis following acute liver injury.[J] .J Hepatol, 2020, 73: 349-360.

[2] Samir Parimal,Kesavardhana Sannula,Patmore Deanna M et al. DDX3X acts as a live-or-die checkpoint in stressed cells by regulating NLRP3 inflammasome.[J] .Nature, 2019, 573: 590-594.

[3] He Wan-ting,Wan Haoqiang,Hu Lichen et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and required for interleukin-1β secretion.[J] .Cell Res, 2015, 25: 1285-98.

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