通过LC3-Ⅱ水平看细胞自噬的发生

自噬(autophagy)是在真核细胞中,过量或异常的细胞器被双膜泡隔离并交付给溶酶体/液泡后被降解,回收利用细胞性物质及清除受损细胞器或有害的蛋白质的过程。
自噬的过程包括隔离膜(isolation membrane)或自噬前体(pre-autophagosome)的形成及延伸、自噬体(autophagosome)的形成、自噬体和溶酶体融合后形成自噬溶酶体(autolysosome),最终胞内物质降解,产生的降解产物如氨基酸、脂肪酸等可被细胞再利用。

 

自噬在维持细胞内稳态发挥重要的生物学作用
应对外源性刺激,自身降解重新获得生长所需营养物质。

细胞自我更新,降解胞内衰老蛋白和细胞器后重新合成蛋白和细胞器。

防御性清除胞内受损大分子物质,维持细胞正常功能。

既然自噬对维持细胞稳态如此重要,那么,自噬检测怎么做呢?说到这里就不得不提到公认的自噬标志物——微管相关蛋白1的轻链3(microtubule-associated-proteinlight-chain-3,LC3)。
正常情况下,LC3以未脂化的可溶性形式存在于胞浆中,被称为LC3-Ⅰ,其分子量为18kDa。
自噬形成时,LC3-Ⅰ酶解转化成为膜型LC3,又被称为LC3-Ⅱ,其分子量为16kDa。
LC3Ⅱ在聚丙烯酰胺凝胶上表现出的迁移率高于LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ与噬小体/自噬溶酶体的数量呈正相关,所以LC3-Ⅱ被广泛地应用于定量细胞自噬的活性。
作为专业的生命科学医药原料供应商,Cell Biolabs中国区金牌代理,艾美捷科技为您推荐:细胞自噬分析检测试剂盒
货号 CBA-5115
名称 Autophagy Immunoblot Kit (LC3-II Detection)

自噬免疫印迹试剂盒(LC3-II 检测)

检测方法 WB
结果图

泳道 1:预染蛋白marker

泳道 2:HeLa 对照裂解液(未去除胞质 LC3)

泳道 3:氯喹处理的HeLa 裂解液(未去除胞质 LC3)

泳道 4:HeLa 对照裂解物(去除胞质 LC3)

泳道 5:氯喹处理的HeLa 裂解液(去除胞质 LC3)

货号 CBA-5116
名称 Autophagy ELISA Kit (LC3-II Quantitation)

自噬ELISA检测试剂盒(LC3-II定量)

检测方法 ELISA(检测细胞裂解液)
结果图

氯喹处理的HeLa细胞中LC3 的ELISA检测结果。将HeLa细胞用50μM氯喹过夜处理。细胞质LC3去除后,用1X RIPA 缓冲液中制备HeLa 细胞裂解物。按照操作步骤测定15μg HeLa裂解物中的 LC3-II水平。

货号 CBA-5117
名称 Cellular Autophagy ELISA Kit (LC3-II Quantitation)

细胞自噬ELISA检测试剂盒(LC3-II定量)

检测方法 基于细胞的ELISA
结果图

氯喹处理的HeLa细胞的LC3 ELISA检测结果。HeLa细胞在96孔板中用50μM氯喹过夜处理。细胞质LC3去除后,按照操作步骤测定对照或氯喹处理的HeLa细胞中的LC3-II水平。

 

 

LC3与绿色荧光蛋白(GFP)结合成LC3-GFP显示出与LC3相同的过程,并且可通过监控液泡输送和GFP-LC3后续的分解而示踪自噬通量。
当自噬通量正常,存在于自噬体内部的GFP-LC3在自噬体膜融解且暴露于液泡水解酶的内容物被裂解。
GFP-LC3的蛋白水解可释放出一个完整的GFP部分,因其对降解有相对抗性,可作为自噬产物累积在液泡。
自由的GFP水平增加可被检测且可通过Western印迹分析进行定量,并与自噬率相关。
GFP是酸敏感型GFP蛋白,由于自噬溶酶体内部的酸性环境,可以导致pH下降、GFP淬灭,因此,GFP的强弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。
除了以上LC3-II检测试剂盒,Cell Biolabs当然还可以提供GFP-LC3表达质粒(cat#CBA-401):

 

左侧是pCMV-GFP对照质粒;右侧是pCMV-GFP-LC3表达质粒

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