Caspases酶系列1:底物及抑制剂

最近很多小伙伴向我们咨询各种Caspase的底物,今天小艾就来跟大家好好聊聊Caspase家族及各类Caspase酶对应的底物,Caspases(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶)是一类蛋白酶家族,其功能与凋亡(程序性细胞死亡),坏死和发烧(炎症)的过程密切相关。

什么是胱天蛋白酶?

胱天蛋白酶(Caspases)是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体,例如TNF-α 受体,FasL受体,TLR和死亡受体,以及Bcl-2和凋亡抑制剂(IAP)蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号(外部或内在)刺激被激活,即会参与执行下游蛋白底物的水解作用,并触发一系列事件,导致细胞分解,死亡,吞噬作用和细胞碎片的清除。
人Caspases酶
人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类:第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成,他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成,而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成(表1)。
表1. 人胱天蛋白酶的功能分类

启动器Caspase和效应器Caspase酶

根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用,胱天蛋白酶可分为两类:启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点,Caspase酶的识别位

凋亡启动器Caspase酶,例如caspase-2,-8,-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物(DISC)是必不可少的,并且在激活后,Caspase-8激活下游效应子Caspase(例如Caspase 3)并介导线粒体中细胞色素c的释放。
Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3,-6和-7虽然不负责启动级联途径,但是当被激活时,它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3(CPP32 / apopain)是关键效应器,因为它放大了来自启动器Caspase的信号,使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测,可以检测Caspase-3的活性。
Caspase酶底物和抑制剂

Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成:Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同,一般由三个或四个氨基酸组成(表2)。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基(Ac)或碳苯甲氧基(Z)基团修饰,以增强膜的通透性。
对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点,释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用,其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。
表2. Caspase的底物及其序列

Caspase酶的显色底物

Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成,常见的生色团有pNA(对硝基苯胺或4-硝基苯胺),可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。
表3. Caspase的显色底物

Caspase的荧光底物

Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团,例如7-氨基-4-甲基香豆素(AMC),7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC), Rhodamine 110(R110)或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物(例如AMC和AFC)更敏感,但由于两步裂解过程,其动态范围更窄。建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定,而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

 

图.从左到右,分别是AMC(7-氨基-4-甲基香豆素),AFC(7-氨基-4-三氟甲基香豆素),Rhodamine 110(R110)和ProRed™620的激发和发射光谱。
表4.荧光半胱天冬酶底物

注意:
1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数(单位= cm -1M -1)。
2.Φ=水性缓冲液(pH 7.2)中的荧光量子产率。

Caspase抑制剂

Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接,通常,Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列,诸如醛(-CHO)或氟甲基酮(-FMK)的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的,而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用,因此,它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。
表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

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