本教程对广州中医药大学基础医学院中西医结合基础研究中心的高内涵细胞成像分析系统(GE, IN Cell Analyzer2200)的操作流程进行简要介绍。

视频教程

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图文版数据采集教程

1. 开机：

开计算机，打开仪器的电源开关（仪器初始化约需5分钟，前面板的灯由三色（红，绿，黄）变为一色（绿色），载物台舱门打开又合上），点击桌面上的IN Cell 2200图标打开软件。

2. IN Cell操作软件的主菜单和主工具栏：

调焦工具：在优化曝光时间、设置软件自动聚焦起始位置和 Preview Scan 时，都需要通过这些工具获取清晰的图像

3. 打开 Assay Development 界面：

主菜单 Mode>Assay Development；或主工具栏上，点击 。在 Assay Development 的工作区编辑视图中可以看到四个窗口：

4. 放样品：

点击舱门滑开，放入样品板或玻片，在Plate/Slide View 窗口点击任何位置，舱门关闭，平板自动进入拍照位置。

5. 建立 Protocol

（Protocol Designer 窗口的编辑，可以按照 Wizard 的步骤，也可以随机设置）：
1) Description Card：1）命名，斜线和竖线不能出现在名字中；2）需要备案的实验信息；3）如果需要可以设置密码；
2) Plate/Slide Card：1）选择所用的是平板还是玻片，以及它们的型号，建立新的类型，在主菜单 Applications>Plate/Slide Manager 窗口中设定。注意：基于激光的硬件自动聚焦需要准确的孔板 Bottom thickness 和 Skirt height 参数，如果不知道孔板的这些参数或硬件聚焦效果不理想，可以对这两个参数进行检测修改。

可以用以下两种方式检测修改板的参数，推荐用后一种方法。
第一种：主菜单 Application > Hardware > Laser autofocus trace

第二种，者直接点击窗口右上角的Verify LAF

蓝色峰标出的是检测值，红色代表该孔板目前参数对应的位置，判断其中的差别，如果想修改，点击Apply Calculated Parameters，在跳出的Plate Editor窗口中点OK即可。

3) Objective Card：1)选择物镜；2）如果该物镜配有SAC环，SAC值等于平板底部厚度值除以 1000。 4) Specimen Card：如果是玻片样品，需要这个选项卡：1）样品是在玻片上还是盖玻片上；2）组织切片的厚度。5) Microscopy Card（这一步主要目的是优化曝光时间）：1）填入成像通道的数量，点击，打开Wavelength Manager窗口，查看和定义新的波长对；2）binning值；3）勾选[polychroic]，从下拉菜单中选择，如果此项不做选择，protocol 不运行；4）勾选[link 3D Parameters]，所有通道的 3D 图像 Z Slices 和 Z Step的参数将保持一致；5）如果有平场校正文件，勾选[Save Flat Field Correction]，将平场校正文件作为实验数据的一部分。

为每个使用的荧光选择激发和发射波长，并选择成像形式，有八种形式供选择：1) 2D：生成单个的 tiff文件；2）2-D Deconvolution：去卷积，生成单个的 tiff文件，对比度和分辨率比 2D 图像高；3）2.5-D：相机整合样品特定 Z 段的信号，去卷积后得到伪三维投影，生成单个的 tiff 文件；4）Adv 2D Deconvolution：系统对一组三张 slice 的 Z 叠加图像进行去卷积，然后保存中间的一张，生成单个的 tiff 文件；5）Phase Contrast：系统从三张图像产生位相图：焦点，焦下和焦上。焦下和焦上图像相对于焦点的距离是一样的，利用位相图和接收到的强度数据，生成单个的 tiff 文件；6）DIC：利用起偏镜和棱镜分解重组光束，通过样品，得到伪三维无阴影图像，生成单个的 tiff 文件；7）3-D：Z 叠加的三维图像，为每一个 Z slice 生成一个 tiff 文件；8）3-D Deconvolution：三维去卷积，为每一个 Z slice 生成一个 tiff 文件。

填入曝光时间，点击Visuals工具，确保灰度信号峰的主体分布在30000以下，以避免信号过饱和。

如果选择 3-D 或 3-D Decon，填入 Z-slice 和 Z-step 数值；如果选择 2.5-D，填入 Z section 厚度值。点击每个通道后面的图标，使用目前参数到的图像会出现在 Image Preview 窗口中，点击主工具栏得到聚焦的图像。（只有 Microscopy Card 中使用正在编写的参数成像，Image Preview 窗 口中的图标得到的是 Wavelength Chooser 窗口条件下的图像；点击 Microscopy Card 中的图标， Wavelength Chooser 窗口会自动更新。）

6) Focus Card：a) Laser Autofocus only，点击 Auto offset 自动计算 offset 值，图标可以用来检测曝光时间、聚焦方法和 offset 值是否合适，点击该图标，图像出现在 Image Preview 窗口中；

b) Software Autofocus only，通过运算找到聚焦最好的 Z 轴位置。Mode 中 Adaptive：large-400um， medium-200um，small-100um；Static：输入自己认为合适的数值。如果 SWAF only，[First Wavelength only]，只出现在第一个通道后面，其他通道后面是，作用相同。注意：只做软件自动聚焦时，一定要填入起始点，Initial Focus 中的值是主工具栏调焦工具调焦后，点击，这个值就会出现。

c） laser autofocus 和 software autofocus 可以联合使用。

7) Processing Card： 分为三个部分，1）3D Deconvolution：方法有 Ratio，保守，可靠，点状荧光使用 Ratio 去卷积后效果好；Enhanced，速度快；Additive，信噪比低的时候也可以处理；Enhanced Additive，速度快。去卷积做几个周期；更多选项；2）Phase Contrast：选择滤波的程度和是否做相位反转；3） DIC：contrast angle，combiner prism，intensity modulation（振幅数据，吸收效果是否包含在图像中）。

8) Plate heater Card： 是否开启温控，以及温度值

9) Liquid handling Card： 1）选择试剂的位置，所用微孔板必须和样品微孔板规格相同；2）编写移液步骤，参见 User Manual。

点击主工具栏中的图标：

10) Time Series Card：定义拍照和自动加样操作的时间间隔

Spit and stare：实验周期短，当前孔的所有操作结束后，再移到下一个孔；
Look walk look：实验周期长，软件自动统筹操作的流程以缩短实验的时间。

12） Acquisition Options Card：1）选择拍照的路线，如果选择 SWAF Adaptive Mode，路线选择 Serpentine；2）Batch analysis；3）是否启用 Cell counting，找到需要的细胞数为止，点击 Sample Now，在 Image Preview 窗口中查看效果。

6. 保存 Protocol 文件：

主菜单 File>Save or Save as，保存后可以调出编辑。

7. Acquisition Mode（按照预设的 protocol 成像）：

放入样品，打开一个 protocol 文件（主菜单 file-open），运行 Protocol 主菜单 Mode>Acquisition；或主工具栏上，点击。
在 Acquisition 的工作区编辑视图中可以看到：Plate/Slide View，Wavelength Chooser，Image View 三个窗口

1） 选择感兴趣的区域（一般是生长着合适密度细胞的地方，大多数情况下，各个孔细胞的生长分布是一致的，例如，药物去除中心区的细胞比去除边缘的细胞更容易）：1）选择一个孔；2）选择一个低倍镜；3）选择波长，binning 值和曝光时间，4）点击这个孔得到一张快照。或做 Preview Scan：如上选择孔、物镜和波长，在 Plate/Slide View 窗口点击图标中的箭头，设定曝光时间和分辨率，binning 值高的时候，强度增大，曝光时间要降低；点,回到 Plate/Slide View 窗口，鼠标变为十字，点左键拖过孔板，棕色方框圈选出预览的区域，主工具栏点击，图像陆续出现，可将 Plate/Slide View 窗口放大以利于观察，如果图像没有聚焦，用主工具栏的调焦工具调节（如果是相差或微分干涉成像，需要在 Microscopy Card 中调整曝光时间和预览）。

2） 选择成像的视野：1）在 Plate/SlideView 窗口中点击图标，Setup Fields to Acquire 窗口打开，2）设定每个孔成像视野的数量；3）视野的分布：勾选 Fixed Layout，通过 x、y值设定，需要拼图的时候，选择图像重叠程度（% Overlap 一般是10%），观察的目标越分散，重叠度应越高，以保证拼接的边界可以准确排列，点击，该图标变为淡绿色，这时可以拖动视野到孔的其他位置，点击[Re-center]回到初始的位置。不勾选 Fixed Layout，点击[Randomize]，视野会随机分布，同时[Exclusion Zone] 会激活，4）勾选Exclude，选择是中心区还是边缘部分被排除，填入一个数值（被排除部分的大小），再次点击[Randomize]，视野分布在未排除区域。
注意：所有孔视野的数量、分布完全相同。

3） 选择需要成像的孔：Ctrl+鼠标左键，点选任何孔，或拖曳过一片区域选择一组孔，被选中的孔外围变为黄色，Ctrl+Shift+鼠标左键，去选择。

4） 开始拍照：主菜单>Application>[Start Acquisition session…]，或点击，Acquisition Session 窗口打开，给 image folder 和 data folder 命名，点击[Run]开始拍照
5） 监控拍照过程：已拍过的视野是黑色的，正在拍的视野是红色的。在拍照过程中或之后，主菜单>Application>Processing Queue 来查看 3D-Decon 或 Advanced 2D-Decon 的进行状态。如果有些图拍照完成后没有看到，还在处理过程中，打开 Processing Queue 窗口查看，可以停止和取消某些处理项目。
6） 监控波长的设置
7） 查看获得的图像：点击 Image View 窗口中的图标，设定显示图像的数量，点击可以调整荧光通道的数量。

8. Data Review Mode：

主菜单 Mode>Data Review；或主工具栏上点击。在 Acquisition的工作区编辑视图中可以看到：Image Stack Review 和 Image Data Review 两个窗口。
1) 打开图像文件夹：主菜单>Application >open image stack 或在 Image Stack Review窗口中点击。
2) Image Stack Review 窗口

3) Image Explorer 窗口：鼠标右键点击任何孔，选择[Explore Image] ，Image Explorer 窗口打开，在这个窗口，可以修饰图像，测量距离，制作电影。

9. Environment Control Window：

CO2 需经过 water bottle 加湿，water bottle 加水量 100ml，水量不能少于 75ml。

10. Microscope Mode：

主工具栏点击，按空格键，当前视野的图像全屏显示，四边有各种工具组。

部分快捷键：

Esc	退出全屏显微镜模式
Spacebar	为活动图像照快照
F5	Laser autofocus
F6	Software autofocus（400um）
F7	Software autofocus（200um）
F8	Software autofocus（100um）
按空格键后，鼠标变为，以	下快捷方式激活
Mouse wheel	图像放大或缩小
Ctrl + Mouse wheel	显微镜粗调（coarse focus）
Ctrl + Shift+ Mouse wheel	显微镜微调（fine focus）
Mouse right click	以该点为中心放大
Shift + Mouse right click	以该点为中心缩小

11. 关机：

关闭软件，关闭仪器电源开关，关计算机。或通过软件 Application>Hardware-Shutdown 关机。

附：滤光片、分光镜的选择