肿瘤：DNA甲基化-TF-基因预后标志物

小伙伴们大家好呀，今天要为大家介绍的是于2020年7月15日发表于Frontiers in genetics（IF=3.258）的文章，题目为Identification of Transcription Factor/Gene Axis in Colon Cancer Using a Methylome Approach，作者单位是吉林大学第三医院胃肠大肠肛门外科。

本研究的研究重点是从DNA甲基化挖掘结肠癌新的候选标志物。结肠癌是全球最高发癌症之一。DNA甲基化被认为是用于癌症预防、诊断和治疗潜力标志物。在结肠癌中，DNA甲基化介导的调控事件的检测对于挖掘新型生物标志物至关重要。已有研究表明DNA甲基化可以通过多种机制促进癌症的进展。研究发现 DNA甲基化的变化会抑制或促进转录因子（TFs）的结合，并进一步干扰基因调控。本文想通过TF-CpG-基因三联体的研究，筛选新可能用于结肠癌预后的新生物标志物。

DNA甲基化联合TF和基因筛选新型癌症预后标志物

科学问题

结肠癌是全球发病率和死亡率的主要原因之一。结肠癌的致病性被认为是一个多阶段且复杂的过程。基因表达的异常改变在结肠癌的发展中具有重要作用。先前的研究强调并表征了转录因子（TFs）在结肠癌中的作用。DNA甲基化是广为人知的表观遗传修饰之一，已显示出可以在时间和空间上特定的方式调节基因表达。甲基化组的改变可以通过通路模块促进癌症的发展。在结肠癌中，抑癌基因的高度甲基化通过沉默转录促进癌变。异常的DNA甲基化位点可能参与与TF的串扰并影响下游转录调控。先前研究报道也发现了TF与基因启动子区域的未甲基化位点结合。因此，检测结肠癌中激活的TF，结合DNA甲基化状态和TF-基因调控关系，将有助于结肠癌研究。

结果分析

（1）首先，研究研究了基因表达谱。在健康样本和疾病样本之间，使用t检验和FC在结肠癌数据集中检测到明显失调的基因，设置筛选条件是FDR<0.05，| log2fc=””>1。结果发现了有623个上调，有816个下调（图1A）。然后，为了进一步探讨了临床作用基因和结肠癌相关基因的表达模式，采用TARGET和MalaCards数据库分析。结果发现，在这些失调的基因中，有19个是临床可操作基因，有25个与结肠癌有关（图1B，C），并且在这些功能基因组中上调和下调的基因之间没有明显差异（图1D）。

图1. 结肠癌中基因表达的特征

（2）接下来，试图探索甲基化位点和失调基因之间的关系。研究发现针对1,439个失调基因，有14,066个CpG位点映射到1,314个基因。接下来，使用这14,066个CpG位点进行了主要成分分析（PCA），并根据前三个主要成分进一步检查了结肠癌和邻近粘膜样品的特征（图2A）。根据PCA结果，结肠癌和邻近的粘膜样品具有明显的甲基化特征（图2B）。这表明与邻近的粘膜样品相比，失调的基因启动子内的DNA甲基化在癌症样品中具有不同的模式。然后，使用相关统计数据鉴定了甲基化基因对（图2C），并将显着相关的对标记为emQTL（表达-甲基化定量性状基因座）。在14,185个甲基化基因对中，将近24％（3,402）对具有显着关系（图2D）。此外，大多数（90％）emQTL显示出负调控，这与以前的发现一致，即DNA甲基化可以阻断启动子活性并抑制基因表达。

图2. 启动子CpG位点与宿主基因之间的关系

（3）DNA甲基化位点已显示在调节TF结合事件中起重要作用。紧接着，研究探讨了emQTL中TF的出现，结果在754个CpG位点中识别出721个TF基序。然后，在计算了这些基序的比值比后，在373个CpG位点中鉴定出223个TF基序。通过皮尔森相关性研究，研究了每个TF和相应的CpG位点之间的关系，结果获得了33对TF–CpG对，包括23个TF和31个CpG位点，并确定了29对TF基因对（图3A）。最后，基于已识别的TF，CpG位点和基因之间的关系构建了一个网络（图3B）。结果显示，GFRA1启动子中有两个CpG位点（cg06298519，cg25617725），cg06298519与TF E2F7相关，而cg25617725与TF NR3C2和NR3C1相关（图3B）。cg06298519和cg25617725的甲基化水平与GFRA1的表达呈负相关。TF NR3C2和NR3C1均与GFRA1正相关，而E2F7与GFRA1负相关（图3C）。这表明NR3C2和NR3C1可能相互配合来调节GFRA1。接下来，测试了E2F7，NR3C2和NR3C1之间的表达相关性。E2F7分别与NR3C2和NR3C1负相关（图3D）。因此，尽管TF E2F7与NR3C2和NR3C1相比对GFRA1表现出相反的调节作用，但它在结肠癌中没有竞争性作用。该网络中基因失调可能是由DNA甲基化位点和其启动子中的TF结合之间的协同作用引起的。因此，确定它们在癌症样品中的联合作用将对结肠癌的治疗和预后有益。

图3. 结肠癌TF-CpG-基因网络的构建

（4）先前的研究已经确定了许多癌症的预后标志物，包括DNA甲基化位点和编码基因。但是，这些研究中的大多数仅限于一种分子水平。为了更全面地评估患者的预后，这里联合分析了DNA甲基化位点，TF和基因对患者生存时间的影响。对于每个三元组，我们使用训练集基于风险系数通过应用多元Cox比例回归模型构建风险模型。在训练集中，GLIS1_cg22444507_ITIH5三联体与生存时间显着相关（图4A，B）。同样，在测试集中，使用与训练集相同的模型为患者分配风险值，并且还可以将其显着分为低风险和高风险组（图4C，D）。此外，考虑到治疗对生存的影响，我们在仅接受化疗的部分患者中测试了GLIS1_cg22444507_ITIH5三联体的效率。结果表明，GLIS1_cg22444507_ITIH5与仅接受化疗的患者的生存率相关（图4E，F）。这些结果表明，GLIS1_cg22444507_ITIH5三联体是结肠癌预后的潜在生物标志物。

图4. 基于风险模型的结肠癌样本生存分析

（4）获得了四个与患者生存时间显着相关的TF-CpG-基因三联体，基于此，文章设计了一个框架来评估结肠癌样本的预后风险评分。一个三联体TF-CpG-基因GLIS1_cg22444507_ITIH5可以成功地将结肠癌样本分为低风险和高风险组。在该三联体中，GLIS1可能识别相应的基序并结合cg22444507周围的DNA序列（图5A）。GLIS1的结合反应可能导致cg22444507的DNA甲基化水平降低（图5B）。此外，cg22444507的DNA甲基化可能负面调节ITIH5的表达（图5C）。而GLIS1可以促进ITIH5的表达（图5D）。因此，GLIS1和cg22444507可能相互配合并影响ITIH5的表达。ITIH5（α-胰蛋白酶抑制剂重链5）已被鉴定为由启动子高甲基化介导的新型乳腺癌预后标志物，并且是结肠癌中的新型候选肿瘤抑制基因。

图5. GLIS1_cg22444507_ITIH5三联体的生物学解释

总结

本文探讨了位于差异表达基因启动子区域的CpG位点的影响，并使用表达-甲基化定量性状基因座鉴定了甲基化与基因的关系。研究结果发现启动子甲基化位点主要是负调控相应的基因，还确定了可以与序列依赖的方式绑定到这些站点的候选TF。通过整合转录组和甲基化组图谱，本文构建了结肠癌的TF-CpG-基因调控网络，该网络用于确定TF和甲基化在转录过程中的作用。最后，基于TF-CpG-基因之间的关系，设计了一个评估患者预后的框架，该框架表明一个TF-CpG-基因三联体与患者生存率显着相关，并且可能用于结肠癌预后的新型生物标志物。研究证明了TF和DNA甲基化之间的合作在结肠癌基因调控中的作用，并确定了TF-CpG-基因事件可能为结肠癌的预后和治疗提供指导。

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