多组学文献：鳞状癌细胞的基因组信号通路网络免疫特征间的差异

鳞状细胞癌（SCC）作为常见的肿瘤类型之一，可能由上消化道和泌尿生殖道的上皮细胞癌变引起。SCC具有共同的组织学特征，然而，目前临床上对于预测SCC的起源，病因，临床行为，预后或最佳治疗方法的研究十分有限。为此，美国阿拉巴马州哈森阿尔法生物技术研究院 Carter Van Waes 主导的研究团队开展了这项工作，其研究结果发表于Cell Reports (IF=8.109; PMID: 29617660)。研究发现，在SCC中染色体或甲基化改变可能影响多个相关基因；这些能够调控鳞状细胞干性，分化，生长，存活和炎症。此外，Copy-quiet型SCCs有高甲基化水平的基因（如(FANCF, TET1）和突变基因（CASP8, MAPK-RAS)。作者还发现出免疫反应外，△p63, WEE1, IAPs, PI3K-mTOR/MAPK可能为SCCs的临床治疗提供潜在靶标。

Genomic, Pathway Network, and Immunologic Features Distinguishing Squamous Carcinomas

文章结构

PART1：基于TumorMap和iCluster分析在SCCs和PanCancer-33 肿瘤亚型中区分其显著特征
PART2：DNA拷贝数变异与生长，有丝分裂DNA的完整性，染色质修饰和死亡途径的mRNA表达有关
PART3：DNA拷贝数变异与HPV感染状态，影响生长，有丝分裂DNA的完整性，染色质修饰和死亡途径的基因突变之间的关系
PART4：DNA甲基化，mRNA表达和突变三者联合揭示了染色质修饰，Fanconi DNA损伤，SRC 激酶家族信号
PART5：mRNA分析可识别SCC亚型：差异表达3q / 11q，氧化性DNA损伤，EMT，转录因子和免疫信号
PART6：PARADIGM途径分析通过信号传导，转录因子，免疫和细胞周期特征区分SCC亚型
PART7：Pan-SCC 蛋白表达
PART8：在SMT中与EMT和转录因子△p63 mRNA的表达和低甲基化相关的miRNA

分析思路

分析工具

SCCs: LUSC，HNSC，CESC，ESCA和BLCA

TM islands: TM岛

TumorMap (TM)：TumorMap实现一种OpenOrd的算法，能够将RNA-seq的数据根据疾病特征对样本进行定位和聚类。

结果展示

Figure 1A

TumorMap图：来自5个起源部位(LUSC，HNSC，CESC，ESCA和BLCA)的SCCs肿瘤紧密共定位 (TM岛在二维图中靠近)。

红色框内：SCCs

灰色区域：剩余的28种泛肿瘤

Figure 1B

Figure 1A中红色框的高分辨率图展示

不同颜色：不同SCCs的类型

Figure 1C

基于不同HPV感染状态的SCCs的TM岛

结合Figure1B-C发现大多数HPV+ CESC和HNSC聚集在一起。

Figure 1D

基于不同吸烟状态的SCCs的TM岛

结合Figure1 B-D发现大多数HPV+ CESC和HNSC聚集在一起。

Figure 1E-I 基于iCluster分析展示DNA拷贝数，DNA甲基化，mRNA表达和miRNA表达

E: iC27：多为lifelong non-smoking（Table S1M）

iC10/iC25：多为HPV(-)

F：1. 所有三个与SCC相关的iCluster (iC10,iC25,iC27)在3q和5p染色体上的拷贝数变异表现为拷贝数增加
2. iC10和iC25在9p染色体上的拷贝数变异表现为拷贝数减少
iC25在11q染色体上的拷贝数变异表现为拷贝数增加

G：DNA甲基化水平（normalized β值）

E-I：多数iC10/25中有更多的DNA拷贝数，更低的DNA甲基化水平，更高的mRNA和miRNA表达。

相反，多数iC27中有更低的DNA拷贝数，更高的DNA甲基化水平，更低的mRNA和miRNA表达。

以上结果提示：大多数SCC是由经常发生的拷贝数变异（recurrent CNV）或其他改变介导；然而，HPV感染状态，表观遗传调控可能在少数SCCs中起着至关重要的作用。

Table S1C，1F，1G

SCC在3q染色体上的相关基因，如SOX2, TP63, 和TP73的表达量显著高于非SCCs。基于基因表达和通路富集的结果提示：SCC与鳞状干性，分化，趋化因子，细胞色素，氧化还原和细胞粘附途径有关。

Figure 1E

TCGA-BLCA中仅有47例在病理学上属于SCCs，其余BLCA在病理学上属于非SCCs。作者表明其余非SCCs的BLCA虽然不能再病理上表现出SCCs的特征，但是在分子特征上可能与SCCs-BLCA有着密切的联系。

此外，乳腺癌，肺腺癌，食管腺癌在分子特征上与SCCs发生聚类。

结果展示 PART2：DNA拷贝数变异与生长，有丝分裂DNA的完整性，染色质修饰和死亡途径的mRNA表达有关

Figure 2A SCCs中所有染色体上的CNV与mRNA表达的平滑的相关系数（ρ值）曲线

计算和可视化方法：MVisAGe R包—>Pearson相关系数

数据来源：Pan-SCC的CNV和mRNA【log2(RSEM + 1) 】

红色：HPV+

黑色：HPV-

箭头：高亮背景区域的染色体中相关系数的最大值

Figure 2B-G

作者进一步分析染色体3q，5p，8p，11q13/q22，14q和19区域内CNV与mRNA表达的相关性。

Table S1A和Figure 2B结果提示SCC得染色体3q的CNV-gain与3q24~3q29区域的众多基因表达有关。其中位于3q26的ACTL6A与更差的预后有关。

据报道，在HNSC的3q28的鳞状分化基因TP63附近，ACTL6A可与致癌N端截短异构体ΔNp63形成复合物。

Figure 2H

相比其他反式激活结构域（TA）异构体，∆Np63α (uc003fsc.2) 和其他∆N异构体更倾向于表达TP63 (RSEM)。

ACTLA6/∆Np63α复合物可协同驱动转录，进一步抑制分化和激活Hippo生长通路的转录co-factor YAP1。

Figure 2E

11q22 扩增与YAP1的表达成显著正相关

Figure S1 C

在SCCs中，3q 扩增（包括ACTL6A和TP63），其发生似乎与位于11q22扩增 (包括YAP1)为互斥的。

11q13.3：CCND1，FADD

11q22.1：YAP1, BIRC2, BIRC3

3q26 和11q22拷贝数增加往往与细胞干性(SOX2 和PRKCI), 永生化(TERC 和FXR1) ，WNT/β-catenin 分化(DVL3)，生长(PIK3CA 和 ZNF639)和生存(BIRC2)等相关基因的表达有关。

Figure 2C

染色体5p的拷贝数增加与染色体不稳定性和有丝分裂相关基因的表达有关。

TRIP13：在HNSC中发挥促进NHEJ非同源末端连接，细胞增殖，生存和顺铂耐药的作用。

此外，TRIP13含chaperonin的TCP-1（CCT）

TERT：与3q上TERC一起形成端粒酶亚基在维持染色体的稳定性发挥重要作用。

Figure 2D

HPV(-) SCC中，Chr 8p11的拷贝数变异与染色体修饰相关基因(WHSC1L1/NSD3)的表达有关。

WHSC1L1/NSD3：编码甲基转移酶并促进组蛋白的单甲基化和EGFR通路的活化。

Figure 2C-F 染色体5p15，11q13/22和14q32的拷贝数变异与NF-kB，ATM信号轴中相关基因的表达有关。

TNFR：肿瘤坏死因子相关受体，如TRAF3

FADD：Fas-associated death domain

BIRC2/3：编码抑制凋亡蛋白，如IAPs

以上基因能够促进NF-kB 发挥存活而非死亡的信号。

TRAF3的拷贝数丢失被视为NF-kB的表达和HPV感染的抑制因素，并且与HPV(+) HNSC更好的预后有关。

Figure 2B-D, F,G

不同染色体上的拷贝数变异与PI3K- AKT-mTOR-eIF信号通路（与细胞代谢，蛋白表达，生长有关）中的多种基因的表达有关。

例如：

3q：PIK3CA 和 EIF2B2

5p：GOLPH3

8p：EIF4EBP1

chr14：AKT1

Chr19：AKT2

以上结果提示CNV可能作为SCCs的驱动因素之一。

结果展示 PART3：DNA拷贝数变异与HPV感染状态，影响生长，有丝分裂DNA的完整性，染色质修饰和死亡途径的基因突变之间的关系

Figure 3A-B

Figure 3A：SCCs的拷贝数变异数据的层次聚类，共分为5组。从拷贝数变异的整体情况为增加到减少，命名为C1-C5，其中大部分C5 A为HPV(+)患者。

Figure 3B：MutSig2CV分析发现有63个基因在Pan-SCC队列的5个肿瘤中的一个或多个肿瘤中的突变频率有显著差异（MutSig2CV分析; FDR<0.1，图中显示了与CNA cluster相关的17个基因突变频率。

较高CNA的C1-C4组有着更高频率的TP53突变(与保持基因组完整性的功能有关)。

较高CNA的C1-C3组有着更高频率的NFE2L2和KEAP1突变 (与氧化损伤有关)。

低CNA C5A和B组有更高频率的EP300，MLL4和CTCF突变（表观遗传修饰）；EPHA2，HRAS，MAPK1和RAC1（有丝分裂原途径成分）；CASP8（细胞死亡介导的半胱天冬酶）突变。

C5A组具有更多的HLA-A和-B突变，提示可能与免疫逃逸有关。

Figure S2 B

EPHA2，HRAS，MAPK1和RAC1中的突变总频率占C5和C5A肿瘤的27％和46％。

其中EPHA2和HRAS突变倾向于在C5中相互排斥（p = 0.037)。

HRAS和CASP8突变倾向于同时发生（p = 0.001)。

Figure S2 C

HRAS，MAPK1和RAC1的突变热点多为突变错义

Figure 3C：Pan-SCC与27种非SCC的基因扩增的比较

Figure 3D：Pan-SCC与27种非SCC的基因缺失的比较

仅与SCC有关的CNV扩增基因为SOX2（干性相关基因）；NFE2L2（氧化性DNA损伤反应）；PDGFRA，IGF1R，CDK6，RAC1，MAPK1，EPHA2和CREBBP（有丝分裂生长和细胞周期），AKT1/3（PI3K信号传导）。

仅与SCC有关的CNV缺失基因为FAT1 / 2，ROBO1，ZNF750，JUB，NOTCH1和TP63（鳞状分化）；KDM5A / 6A，MLL3和NSD1（染色质修饰）；PD-L1和B2M（免疫逃逸）。

Figure 2D,2E, S2D, S2E

TP63和ZNF750的失活缺失或突变支持TP63-ZNF750分化途径失调的可能替代机制

结果展示 PART4：DNA甲基化，mRNA表达和突变三者联合揭示了染色质修饰，Fanconi DNA损伤，SRC 激酶家族信号

Figure 4A-B；Table S2K

鉴定了905个差异甲基化和表达的基因，并通过共识聚类将其分为5组

富含HPV（+）CESC和HNSC的超甲基化C2主要与低CNA簇C5A重叠

Figure 4C-D

SCC簇中的几个新的甲基化差异表达基因已与COSMIC中的癌症发展有因果关系

包括富含甲基化/抑制基因TET1，FANCF和PPARG，在C2 HPV（+）CESC和HNSC，C4 HPV（-）HNSC中富集

Figure 4E

对FANC和DNA损伤修复途径基因分析显示，体细胞甲基化，CNA和FANC-BRCA基因的突变频率异常高（约12％）,提示此途径中的获得性和胚系突变可能有利于一部分SCC的进展

结果展示 PART5：mRNA分析可识别SCC亚型：差异表达3q / 11q，氧化性DNA损伤，EMT，转录因子和免疫信号

Figure 5A-B

K-means聚类分出了6个mRNA表达簇，其中包括重要CN，甲基化和miRNA相关改变相关的mRNA

相反，C3和C6显示较低的表达，并且它们高表达11q22编码的YAP1 / BIRC2 mRNA。富含HPV（+）CESC和HNSC的C5显示11q22（YAP1和BIRC2）的mRNA表达较低；14q（TRAF3）; 和超甲基化基因FANCF，TET1和PPARG。

LCK表达增加与免疫检查点CD274 / PDL1，Treg(FOXP3)，髓样抑制细胞（MDSCs）IDO1的mRNA在C1，C5和C6亚类中的表达重叠，提示它们的表达可能与细胞免疫反应有关。

结果展示 PART6：PARADIGM途径分析通过信号传导，转录因子，免疫和细胞周期特征区分SCC亚型

Figure 6A

将SCC与其他癌症类型区分开，并通过层次聚类分析定义了6个SCC聚类

Figure 6B-E

SCC中重要调控节点的激活：

MAPK-JUN-FOS

免疫相关

TP53/63/73

增殖相关

JUN-FOS，RELA / p50和STAT3形成共同激活的转录因子网络，该因子调节多种癌症和免疫相关mRNA，例如TNF，CXCL1，PTGS2和LCK

结果展示 PART7：Pan-SCC 蛋白表达

Figure S6A

作者使用一组189种抗体来评估748种SCC的反相蛋白质阵列（RPPA）数据，以评估多种癌症相关途径中蛋白质的表达和磷酸化。

无监督聚类确定了6个聚类，这些聚类揭示了蛋白质表达和途径活性的不同模式

结果展示 PART8：在SMT中与EMT和转录因子△p63 mRNA的表达和低甲基化相关的miRNA

Figure S7A

对1,381个Pan-SCC样品的miRNA进行了无监督共识聚类，聚成5类

在SCC和non-SCC中miRNA的丰度截然不同

Figure 7A

SCC中FC最大的两个miR-205-5p和miR-944，以及一组包含miRs-200a-c-5/3p，141-5/3p和429，观察到在miRNA C2和C3中表现出表达降低与EMT得分增加有关

Figure 7B-C

miRTarBase 数据库中识别出anti-correlated mRNAs （筛选标准：FDR < 0.05, Spearman rho ≤ 0.2）

例如：miR-205-5p和miR-200/141和429是与EMT相关的anti-correlated (Spearman rho ≤ -0.4) 。

miR-205和miR-200家族成员发挥了调节SCC亚型中ZEB转录因子的表达和EMT分化基因的作用。

miR-944靶标包括S100PBP，与粘附有关；

SPRY1，EGFR信号传导调节剂；

NPR1，一种抑制NF-kB信号的抑制剂-kB同源物