2019年末出现的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）可导致一种急性的感染性新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。此病有人传染人的能力，在感染初期患者出现不同程度发热、乏力、干咳等症状，随着病程加剧进展，严重者可出现呼吸衰竭、呼吸窘迫综合征或多脏器功能衰竭，导致死亡，严重危害人类的生命健康[1-2]。近期研究结果显示SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，其结构S-蛋白的RBD结构域能够与宿主的血管紧张素转化酶2（ACE2）受体蛋白结合，从而介导病毒的侵入[3]。与冠状病毒（SARS-CoV）相比，SARS-CoV-2 RBD结构域的5个关键氨基酸序列中有4个发生了变化，但变化后的结构域却在整体性上完美地维持了SARS-CoV病毒S-蛋白与ACE2蛋白互作的原结构构象。最新的冷冻电镜结果显示与SARS-CoV相比，SARS-CoV-2的S-蛋白与ACE2蛋白间的结合能力更强，说明SARS-CoV-2通过人ACE2蛋白介导，进而感染人呼吸道上皮细胞的传染力更强[4]。此外，免疫荧光实验发现除了鼠源的ACE2，多种动物来源的ACE2均能够作为SARS-CoV-2感染宿主细胞的受体。因此，以上结果提示ACE2可以作为防治SARS-CoV-2感染的一个理想的药物作用靶点[5]。
我国传统中医药以其整体治疗观、独特的临床疗效、较少的毒副作用及其多成分、多靶点的药效特征，自古以来在抵御流行性瘟疫方面一直发挥着重要作用。近年来，“生物信息学”和“系统生物学”等现代新兴学科与古老的中医药学交叉融合，促进了一个全新学科“中药网络药理学”的诞生。基于大数据分析的“中药网络药理学”旨在从系统层次和分子水平揭示中草药的奥秘，为传统中医药学从“经验医学”迈向“循证医学”开辟了一个新的途径。本研究旨在通过中药网络药理学方法探讨对于COVID-19具有潜在治疗作用的5味中药的药理作用机制，从ACE2靶点入手，为后续进一步的组分配伍研究和临床用药方案提供可能的指导。
1 方法
1.1 查询潜在抗SARS-CoV-2病毒活性的中药活性成分和药物作用靶点
传统中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）是基于传统中草药系统药理学框架而建立的数据库可视化平台[6]。通过TCMSP平台的“targetname”搜索条目输入“Angiotensin-convertingenzyme 2”（即ACE2蛋白），查询针对治疗靶点ACE2的潜在候选中药及相关单体成分。并根据药动学相关参数对相关中药里的潜在活性成分进行适当筛选，参数设置为：口服生物利用度（OB）≥30%；类药性（DL）≥0.18。继续使用TCMSP数据库查询获得所有潜在活性成分对应的药物作用靶点。
1.2 构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络体系
STRING在线分析数据库（Version 11.0）具备强大的可视化展示蛋白间相互作用网络体系的功能[7]。进入页面首先选择“multiple proteins”条目，输入上一步得到的相关靶点名称，并选择“Homo sapiens”进行检索。置信度分值（setting score）选择为0.700，然后下载蛋白-蛋白相互作用结果（tsv格式文件）。将其导入CytoScape 3.2.1软件进行PPI网络可视化，同时使用MCODE插件筛选提取核心子网络，具体参数设置为Degree Cutoff：5，K-core：5，从而获取得到相关核心靶点。一般来讲上述参数值越大，筛选出的相关靶点在该网络体系中的核心度越高，该节点与周围相关节点的联系就越紧密。
1.3 关键核心基因基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析
使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8在线富集分析平台对上述获得的相关核心靶点进行生物功能及信号通路的富集分析。然后使用OmicShare云平台，将上述得到的富集分析结果进行可视化作图。
2 结果
2.1 潜在抗SARS-CoV-2病毒活性的中药活性成分和药物作用靶点
首先从TCMSP平台中以人ACE2为药物靶点反推可能对其存在治疗作用的中药，共找到有5种，即柴胡、葛根、葛花、川牛膝、萱草根，然后进一步使用TCMSP平台中的药动学相关参数对上述5种中药所包含的潜在活性成分进行了筛选。进一步的筛选还发现了直接针对ACE2为治疗靶点的一个潜在单体成分葛根素（puerarin），该单体同时存在于上述5味中药中，尽管其OB值小于30%，最终也将其纳入了候选范围。因此最终纳入的结果为柴胡18个单体、葛根5个单体、葛花19个单体、川牛膝5个单体、萱草根9个单体。将上述单体进行汇总去重复处理，5味中药共含有潜在活性成分42个。随后继续使用TCMSP在线平台，分别探寻上述5种中药中的相关单体对应的潜在药物作用靶点，结果分别为柴胡211个靶点、葛根105个靶点、葛花229个靶点、川牛膝201个靶点、萱草根125个靶点。最后，再将上述5种中药各自筛选出的这些靶点进行去重复汇总后，总共得到240个潜在治疗靶点，5种中药所含潜在单体成分和对应靶点数量示意图见图1。得到的这240个靶点在上述5种中药中同时出现的共有潜在靶点数量为71个，从而提示上述5种中药在药理作用机制方面存在很大程度上的共性。
2.2 PPI网络体系的构建和核心子网络提取分析
为了能够系统性地揭示上述5种中药的药理作用机制，进一步构建了PPI网络体系。首先使用STRING蛋白-蛋白互作在线预测数据库，分别将上述5种中药对应的潜在药物治疗靶点依次输入并进行分析，置信度分值设置为0.700，待生成tsv格式结果后，将其导入CytoScape 3.2.1完成结果可视化，具体结果见表1。考虑到上述5种中药对应的潜在药物靶点在PPI网络体系中的数量及关系较为复杂，因此继续使用Cytoscape 3.2.1软件中的MCODE插件进行复杂PPI网络体系的核心子网络提取处理，将选择出分值排名最高的5个核心子网络用于后续的功能及通路富集分析，5味中药PPI网络体系的拓扑学参数见表1。与此同时，每个核心子网络中按照所处体系核心度排名前10位的靶点结果见表2、图2。
2.3 GO功能与KEGG信号通路富集分析
将上述得到的5个核心子网络中的潜在药物治疗靶点进行汇总并做去重复处理，共得到63个核心靶点。然后再对这63个潜在核心靶点进行富集分析，目的是从整体角度出发，从而系统地研究这5种中药可能涉及到的生物学功能及分子机制。富集分析所得到的相关结果（按照重要显著程度选取排名前10的结果）如下：BiologicalProcess（GO-BP）结果提示5种中药与影响基因转录与表达、信号转导、针对药物反应、炎性反应、G蛋白耦联受体信号通路、细胞凋亡与增殖等过程密切相关。CellularComponent（GO-CC）结果提示5种中药与作用细胞质、细胞核、质膜、核质、胞浆、细胞外空间、蛋白复合物等成分密切相关。Molecular Function（GO-MF）结果提示5种中药与影响蛋白质结合、酶结合、转录因子结合、蛋白质异二聚体活性、DNA结合、转录因子活性、蛋白激酶结合等功能密切相关，见图3-A～C。KEGG信号通路富集结果提示5种中药与影响肿瘤疾病相关通路、乙肝病毒相关通路、PI3K-Akt通路、TNF通路、FoxO通路、流感病毒通路、MAPK通路等密切相关。见图3-D。
3 讨论
柴胡与葛根2味中药是传统中医治疗外感热病的常见配伍，历代医书记载含有柴胡葛根配伍的方剂，其主治病症多与时行瘟疫、外感发热等疾病有关，如《太平惠民和剂局方》中“柴胡石膏散”中含柴胡葛根配伍，用治时行瘟疫，“柴胡升麻汤”含柴胡葛根配伍，治时行瘟疫；清代程国彭《医学心悟》中“柴葛解肌汤用治春温，夏热之病”；清代汪昂《医方集解》中“柴胡升麻汤用治少阳阳明合病，时行瘟疫”。可见柴胡葛根药对配伍应用于传染性、发热性疾病的治疗具有历史源流。现代医学实验研究也证实了柴胡的主要有效成分为柴胡皂苷和挥发油，具有解热镇痛、抗内毒素、调节免疫等作用[8]。而葛根中的葛根素同样具有解热镇痛之功效，两药合用对外感高热疗效确切，可达到明显退热的效果，且平稳无反跳现象[9]。柴胡葛根配伍具有解热、抗炎、抗自由基损伤等作用，可能通过血清中IL-β、MPO等炎性介质的水平和活性间接降低体温，通过降低iNOS活性、NO等自由基的水平减少发热对机体的损伤[10]。因此本实验筛选出的柴胡葛根药对用于治疗COVID-19符合传统中医用药规律，有药理学实验数据支持，为临床应用提供可靠依据。
柴葛解肌汤是柴胡葛根配伍的代表方，是传统中医用来治疗六经辨证中三阳合病的方剂，最早出自明代医家陶节庵的《伤寒六书·杀车槌法》，由柴胡、葛根、甘草、黄芩、白芍、羌活、白芷、桔梗、石膏、生姜和大枣组成。全方以葛根、柴胡为君，葛根味辛性凉，辛能外透肌热，凉能内清郁热；柴胡味辛性寒，轻清升散，透邪达表，为“解肌要药”，且有疏畅气机之功，又可助葛根外透郁热。羌活、白芷助君药辛散发表，并止诸痛；黄芩石膏清泄里热，四药俱为臣药。其中葛根配白芷、石膏，清透阳明之邪热；柴胡配黄芩，透解少阳之邪热；羌活发散太阳之风寒，三阳兼治。全方配伍应用六经三阳合病的常用处方之一，临床内科、儿科广泛应用于外感发热性疾病，苏英豪[11]通过对62例H1N1甲型流感患者的随机对照临床试验，观察对比发现柴葛解肌汤加减组与奥司他韦组在病毒核酸转阴时间、退热时间和流感症状消失时间方面效果相当。可见临床上柴葛解肌汤广泛用于流行性病毒性感冒、上呼吸道感染、医院内感染等急性外感发热类疾病，尤其是病原为病毒，在改善症状、退热等方面较抗病毒西药有很大的优势[11-13]，针对急危重症患者住院期间出现的院内感染同样有效[14]。
根据国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》，此次COVID-19早期轻症患者临床表现为发热、干咳、鼻塞、流涕、肌痛、咽痛、乏力等，同时可兼有腹泻等消化道症状。发热、干咳、鼻塞、流涕为太阳表证，咽干、咽痛为少阳枢机不利，肌痛、腹泻可兼见阳明之证。可见此次疫情早期轻症患者表现出的症状经传统中医六经辨证符合太阳、少阳、阳明三阳合病之证。根据中医理论以及既往临床经验建议可探索性应用柴葛解肌汤加减或柴胡、葛根药对配伍治疗COVID-19此外，川牛膝入血分，具有活血袪瘀的功效，萱草根能够清热利湿、凉血止血、解毒消肿，临床可随症加减应用。本实验筛选的5个中药以柴胡、葛根药对为核心，以柴葛解肌汤为底方加减，根据临证情况加减化裁应用川牛膝、萱草根，为治疗COVID-19打开新的思路，具有潜在指导临床的意义。
此外，本研究对上述5味中药所包含的潜在活性成分又分别找到了各自对应的药物作用靶点，而后进行了一系列PPI网络构建与核心子网络的提取分析。纵观这些核心靶点，发现其与免疫调节方面关系甚密。目前一项最新研究结果表明COVID-19重症患者其体内IL-10、TNF-α等细胞因子的表达量与轻症患者相比显著增加[1]。由于在重症患者体内表达了大量的细胞因子，极易在短时间内形成“细胞因子风暴”，从而引发重症患者呼吸窘迫综合症和多器官衰竭，因此这也可能是截至目前重症患者死亡的重要原因之一。而本研究得到的结果表明IL-1A、IL-1B、IL-6、IL-10、TNF-α等作为上述一些中药的核心靶点与免疫反应直接相关，提示这些中药可能通过免疫调节改善患者的免疫状态，从而发挥治疗作用。
与此同时，本研究还发现ACE2在上述5种中药对应的潜在药物靶点PPI网络体系中，核心程度不是很高，其主要与AGTR1和DPP4存在相互作用，但AGTR1与其他若干靶点存在相互作用，从而提示上述5种中药在治疗作用方面可能更大程度上是从宏观、整体角度发挥的。因为每1味药物中含有多种单体成分，从而具有影响多靶点、多途径的作用方式，并不仅仅局限于针对ACE2单一靶点。此外，另一项最新研究结果表明在ACE2＋ II型肺泡细胞中发现表达多个与病毒组装、复制相关的功能基因[15]，而其中的ICAM1与EGFR是作为本研究在上述的一些中药中预测得到的潜在治疗靶点。具体来看，其中，柴胡、葛花、川牛膝和萱草根均预测到了ICAM1，柴胡、葛花和川牛膝均预测到了EGFR。同时在上述的一些核心子网络体系中，ICAM1为柴胡、葛花和萱草根的核心靶点，而EGFR为川牛膝的核心靶点。这些结果均提示上述中药可能对于SARS-COV-2病毒的组装、复制具有一定的干扰作用。此外，富集分析的相关结果再次表明根据核心靶点预测得到的相关生物学功能及机制大多与病毒如影响转录调控、蛋白或酶结合等关系密切；且上述5种中药在抗病毒方面又具有多靶点、多功能、多途径的药理作用。
综上所述，本研究基于网络药理学相关方法，通过构建核心靶点网络体系研究5味中药的潜在药理作用机制，并进一步探讨药物间组分配伍，从“多成分、多靶点、多功能、多途径”角度，系统阐释了将5味中药应用于治疗COVID-19的可能性，为进一步药理作用研究和临床实践用药提供前期理论指导。
参考文献（略）
来 源：王 耘，潘博宇，房森彪，张 炬，潘战宇，刘立仁． 利用网络药理学方法探讨针对新型冠状病毒肺炎以ACE2为治疗靶点的5味中药的作用机制和组分配伍 [J]. 中草药, 2020, 51(18):4691-4697.
