大家好，我是风。干湿结合的文章已经告一段落，有没有后续目前还未知（主要感觉大家兴趣不大），但是解读非肿瘤领域生信类文章的呼声却一直居高不下，不得不感叹“科研路漫漫，生信动人心”啊！可能昨天刚跟你说生信文章不靠谱的那个人，今天就靠着发表一篇生信文章在主任面前秀了一把，然后从此产生一种“你尽管说，看我信不信你”的想法。说到底还是要“自己先拥有”，才有资格去鄙视这个东西嘛！我一直在思考怎么给大家带来非肿瘤生信文章的解读，奈何自己一直做的都是肿瘤方向，想跨界但是界壁牢不可破啊。
所以在“挑圈联靠”达到10000+粉丝之际，邀请了一位非肿瘤领域的生信能手来给大家解读非肿瘤类生信文章，也就是我们的 风间琉璃 ！风间是一位非常强悍的科研选手，在我刚认识他的时候，他应该算科研刚起步，到现在已经发表了好几篇文章并且我知道的就还有好几个文章在筹备了，这样一位强悍又高产的老师，他看文章的角度又是怎么样的呢？他又能给大家带来什么新的启迪呢？他高产的秘诀又是什么呢？交给你们自己去领会吧O(∩_∩)O（重要事情说三遍：挑圈联靠10000粉了！挑圈联靠10000粉了！！挑圈联靠10000粉了！！！）
下面：正片开始
大家好，我是风间琉璃，咱们又见面了。今天我给大家解读是文献的形式有点特殊。这一次咱们同时领略两篇发表在Plos one期刊上的文章。当然这时候有同学会问了“哎呀，这两篇文章有什么特殊的吗？”。其实也没什么特殊，只是这两篇文章同年发表在同一个杂志针对同一个疾病的同一种套路的两篇不同的文章。怎么样？有兴趣看看吗？那废话不多说，咱么从挑圈联靠来深度剖析这两篇文章的内在套路。
首先我们分别看一看两篇文章的标题，第一篇文章“Expression profiles of circRNAs and the
potential diagnostic value of serum circMARK3 in human acute Stanford type A aortic dissection”。
第二篇文章“Verification of hub genes in the expression profile of aortic dissection”。总结一下，两篇文章都是关注主动脉夹层这一疾病，而前者是聚焦cirRNA分子circMARK3在血清中的诊断价值，后者是聚焦mRNA找出hub genes。两者都是biomarker套路。大家看到这不知道有没有疑惑，做cirRNA和mRNA差不多啦？都发plos one？？？不着急，咱们接着看。
首先：挑——表达差异
前一篇cirRNA文章，作者通过倾向性评分（Propensity score matching, PSM）方法匹配30 vs 30主动脉夹层患者和正常患者，并将其中的10 vs 10送去测序（得到mRNA、miRNA、circRNA），接下来30 vs 30患者组织进行验证（Figure2），并将最后筛选出来的circMARK3作血清水平诊断价值验证（Figure6）（细品一下，emmm为啥送测序的样本也要纳入为验证集，别人不说，咋也不好意思问）。咱们看看，Figure1，常规操作，热图、火山图、不同类型cirRNA构成比的饼图。作者筛选出320个上调、186个下调cirRNA。
我们再看一看mRNA与主动脉夹层的文献，挑这一步同样是采用的6 vs 6胸主动脉夹层和正常对照患者组织，筛选出1928个上调、906个下调mRNAs。并纳入10 vs 10个疾病/对照组织做RNA水平验证（Figure7），5 vs 5疾病/对照组织做免疫组化（Figure8）。我们看看Figure1。分别是数据质控的柱状图、火山图和热图。
circRNA这一篇文章是通过构建cirRNA-miRNA-mRNA调控网络，找到差异表达cirRNA的靶基因，并进行GO、KEGG和GSEA功能聚类（Figure3）。（这一套做得还是挺全的就是图不太好看）
而mRNA这一篇，GO分析做的条图（Figure2），KEGG做了总的气泡图（Figure3），并分别根据上调和下调基因集分别做了两个条图KEGG（Figure4）。
我们先想一想交互网络可以做哪些呢？cicRNA肯定做了ceRNA调控网络，还做了啥？？我们接着往下看。
circRNA这一篇，表达差异的miRNA通过RNAhybrid program预测其潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，并凭借ceRNA网络找出cirRNA靶向mRNA，这一点在前面咱们已经提到。接下来，作者对靶向mRNA来了一次WGCNA找出核心模块，并再通过基因过表达网络找出连接度最高的核心mRNA分子——酪氨酸激酶fgr（Figure4）。并再通过RNAhybrid program预测fgr的靶向miRNAs，预测出来的miRNAs再通过RNAhybrid program预测下游的circRNA，构建新的调控网络，并找出两两之间最低自由能的匹配对，即fgr- miR1273g-3p-circMARK3(Figure5A-C)。（是实话，聚焦circRNA，通过靶基因进行功能聚类挺不错，但是这个通过上游mRNA再通过中游miRNA再来找核心分子circMARK3的方法感觉太过冗余）。
mRNA这一篇：交互网络就做得很简单，首先做了mRNA的PPI调控网络（Figure 5），再通过cytoscape的MCODE插件找出前三个核心模块，并通过cytoHubba插件找出hub基因（Figure6）。
其实这一步，咱们可以看到，circRNA这一篇文献首先做了组织水平的RT-qPCR验证表达差异最明显的前10个circRNA、5个miRNA和5个mRNA，再在血清水平验证circMARK3的诊断价值（ROC曲线）。（Figure6）
而mRNA这一篇文章，咱们之前也提到了，做了10 vs 10组织水平的qRT-PCR和5 vs 5组织水平的免疫组化。
最后，还有一点咱们没讲，circRNA这一篇文章还做了点细胞实验，作者将载有circMARK3的质粒转染到人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells, HASMCs）中,检测到fgr蛋白水平和miR1273g-3p的变化（Figure5I-L）。
好了，咱们从挑圈联靠四个层次把这两篇文献讲完了，有没有小伙伴比较蒙圈啊？如果有，咱们再看看我总结的这个表。
