基于乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染的免疫病理机制，可以采用多种创新策略来增强患者的HBV特异性免疫反应。多种模式识别受体（PRR），如Toll样受体（TLR）、维甲酸诱导基因蛋白I（RIG-I）和干扰素基因刺激蛋白（STING），能够参与HBV的免疫识别。口服、鼻腔或皮下使用PRR激动剂可激活宿主免疫细胞和肝实质细胞及非实质细胞（NPCs），促进IFN和促炎细胞因子的产生，以及干扰素刺激基因（ISGs）的表达。
治疗性疫苗和检查点阻断剂可以诱导和增强HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。过继转移体外活化的T/NKT细胞或基因编辑的HBV特异性T细胞能够更新替代体内耗竭或低能的T细胞，其中最具有代表性的是嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和T细胞受体T细胞（TCR-T）。尽管部分作用已经得到了验证，但临床使用之路仍然横亘着重重阻碍。
慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒治疗的最终目标是追求以HBsAg丢失为主要特征的“功能性治愈”。但目前可用的治疗策略只能在不到10％的CHB患者中实现“功能性治愈”。临床使用的口服核苷（酸）类似物（NUCs）可抑制HBV复制，安全性高，但很少发生HBsAg清除及血清学转换，停药无期；聚乙二醇干扰素α（PEG-IFN-α）可使10-30％的患者清除HBeAg，并发生HBsAg血清学转换，兼具免疫调节特性；但耐受性差，存在不良反应，以及需要皮下给药。
HBV特异性免疫应答功能障碍被认为是持续感染的主要原因。恢复或增强固有免疫，并诱导HBV特异性适应性免疫应答可能有助于清除HBV。与急性乙型肝炎相比，慢性乙型肝炎（CHB）的免疫应答具有以下特点：HBV特异性CD4⁺/CD8⁺ T细胞、DCs和NKs/NKTs功能障碍或数量减少；免疫检查点蛋白程序性死亡受体1（PD-1，CD279）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4，CD152）、T细胞免疫球蛋白黏液素3（Tim-3，CD366）等负性调节因子表达上调；固有免疫应答受损，TLR下调和失活。
在HBV感染过程中，肝免疫系统首先对门静脉的抗原产生耐受。受损的肝细胞释放精氨酸酶和吲哚胺-2,3-双加氧酶（IDO）等，消耗维持T细胞功能所需的氨基酸，从而抑制T细胞功能。肝内炎症募集调节性T细胞（Treg）、B细胞和骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs），并激活星状细胞，产生IL-10和TGF-β。肝脏的免疫抑制可避免炎症引发的严重损伤，但也损害了HBV特异性T细胞的功能。高水平的HBV DNA、HBsAg和HBeAg有助于维持CHB患者的HBV特异性免疫耐受。目前已经证明，从抗-HBs阳性供体中过继转移骨髓可在受体中实现HBV清除；肝移植可将免疫细胞从接种疫苗的供体转移到受体，并部分控制肝脏的再感染。这些发现提示，免疫调节具有治疗HBV感染的潜力，越来越多的研究开始探究小分子等免疫治疗策略。
01
增强固有免疫以建立抗病毒状态：临床前研究
模式识别受体激动剂：
TLR配体：TLRs广泛表达于免疫细胞和肝实质/非实质细胞，可识别病毒和细菌的病原体相关模式分子（PAMPs），在固有免疫中发挥重要作用，并衔接适应性免疫。Isogawa等首先证明，对HBV转基因小鼠模型单独使用TLRs-3、4、5、7和9的特异性配体，可在24小时内以非细胞毒性的、IFN依赖性的方式抑制肝内HBV复制。TLR配体可通过IFN依赖性和非依赖性途径有效抑制原代肝细胞和肝癌细胞中的HBV复制。TLR-2和4的激动剂在肝癌细胞和土拨鼠肝细胞中能够抑制土拨鼠肝炎病毒（WHV）复制。用TLR配体刺激NPCs（KCs和LSECs）和DCs可诱导一系列抗病毒因子（如I型IFN）的合成，在体外抑制HBV复制。TLR激动剂不仅可以激活肝脏中的实质细胞、NPCs和浸润的免疫细胞，还可以募集循环中的免疫细胞以建立抗病毒状态。TLR激动剂主要诱导炎性细胞因子和趋化因子应答。最近有研究发现，TLR激动剂可通过代谢调节直接促进T细胞功能。但需要考虑TLR激动剂带来的全身炎症反应。
TLR-9 的天然配体是病毒和细菌基因组中的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸序列 (CpG)。连续16周，每周向慢性感染WHV的土拨鼠皮下注射CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）可诱导IFN的合成，出现较弱的短暂病毒抑制作用。有研究表明，CpG ODN可以增强抗病毒治疗的效果。
GS-9620是TLR-7的一种配体，已在土拨鼠和黑猩猩模型中展现出了治疗潜力；GS-9620可在人PBMCs中诱导多种HBV抑制因子，延长PHH和HepaRG细胞中I型IFN相关的HBV抑制作用，增强免疫蛋白酶体亚基的合成，并可能暴露感染HBV的PHH中的一种免疫优势病毒多肽，促进宿主的T细胞识别和激活并控制病毒。
图1. GS-9620作用机制
【Niu C, Li L, Daffis S, et al. Toll-like receptor 7 agonist GS-9620 induces prolonged inhibition of HBV via a type I interferon-dependent mechanism. J Hepatol. 2018;68(5):922‐931. doi:10.1016/j.jhep.2017.12.007】
RIG-I激动剂：SB9200是RIG-I和核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（NOD2）的激动剂。WHV感染的土拨鼠口服该激动剂12周后可延长血液/肝中IFN-α/β和ISG的活化，降低血清WHV DNA和WHsAg；在使用恩替卡韦（ETV）后序贯使用SB9200可以更显著地抑制WHV，延迟病毒复制的复发。因此，SB9200诱导的宿主应答增强了NUCs的抗病毒效应。
STING激动剂：宿主的环状GMP-AMP合成酶（cGAS）可以识别HBV DNA并激活其接头蛋白STING，促进ISG56表达并抑制病毒组装。双链DNA（dsDNA）或环鸟苷酸-腺苷酸（cyclin GMP-AMP, cGAMP）激活cGAS-STING通路，可显著抑制细胞和小鼠模型中HBV的复制。小鼠STING的激动剂5,6-二甲基黄嘌呤酮-4-乙酸（DMXAA）在水压动力构建的HBV小鼠模型中显著诱导ISG的表达并减少肝脏HBV DNA的产生。DMXAA主要诱导I型IFN主导的细胞因子反应。人肝细胞中STING的表达尚存争议。用cGAMP或DMXAA处理感染HBV的肝癌细胞可显著抑制HBV复制，胞内HBV mRNA、核心相关DNA和分泌的HBsAg降低，但cccDNA数量无明显改变。
MITA（Mediator of IRF3 activation）相关蛋白（MRP）是MITA/STING的剪接异构体，可特异性阻断MITA相关的IFN激活，同时仍诱导NF-κB通路。MRP过表达小鼠的HBV复制受到抑制；反之，MITA/STING缺陷增强了小鼠的HBV复制。MITA/STING缺陷动物的HBV特异性体液免疫应答和CD8⁺ T细胞应答减少，表明MITA/STING在抗HBV免疫的固有和适应性应答中发挥重要作用。总而言之，STING有望成为CHB免疫治疗的靶点。
图2. 增强固有免疫并建立抗病毒状态的方法。激活固有免疫可诱导抗病毒和炎性介质的产生，并在不同程度上抑制病毒；适应性免疫也不可或缺。目前只有TLR7配体GS-9620已在临床试验中进行了测试。
APOBEC调节的脱氨：载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽 (APOBEC) 家族是一类高效的胞苷脱氨酶。其中，APOBEC-3参与宿主对HBV的固有免疫，最早在2005年报道人APOBEC-3能够通过胞苷脱氨作用编辑HBV DNA。在感染HBV的HepAD38和HepG2.2.15细胞中，内源性胞苷脱氨酶可以编辑病毒衣壳内10–25％的HBV rcDNA基因组。热休克蛋白90（Hsp90）可增强APOBEC-3介导的HBV DNA脱氨活性。APOBEC-3酶可能通过胞苷脱氨作用介导I型IFN和淋巴毒素的抗病毒活性，从而导致cccDNA降解。
图3. 高剂量IFN-α处理或LTβR激活分别上调A3A和A3B的表达，随后它们在感染的肝细胞中与HBV核心蛋白共定位或直接相互作用，移位到细胞核，在HBV核心蛋白的作用下与cccDNA紧密接触。APOBEC可以使在转录过程中瞬时变成单链的cccDNA脱氨基。HBV cccDNA中的尿嘧啶被细胞DNA糖基化酶识别并切除，导致脱嘌呤嘧啶（Apurinic/Apyrimidinic，AP）位点的形成；AP 位点被细胞AP核酸内切酶识别，cccDNA因此被降解。
【Lucifora J, Xia Y, Reisinger F, et al. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science. 2014;343(6176):1221‐1228. doi:10.1126/science.1243462】
02
诱导HBV特异性免疫应答
（1）蛋白质/多肽疫苗：
HBsAg/preS疫苗：常规HBsAg疫苗在动物模型或CHB患者中治疗效果不理想，这归因于HBsAg特异性免疫耐受。而使用IL-12作为佐剂时，HBsAg免疫接种可有效逆转HBV感染小鼠对HBV蛋白的系统性耐受，HBV特异性CD8⁺/CD4⁺ T细胞应答增强，CD4⁺ Foxp3⁺ Treg细胞减少。大多数接种基于IL-12的疫苗的动物血清HBsAg转阴，肝细胞中HBcAg低于检测下限。preS1多肽也可以增强HBV感染小鼠的免疫应答。序贯使用preS1和HBsAg疫苗，抗preS1抗体可以清除HBV病毒颗粒，甚至引起HBsAg/HBsAb血清学转换。
HBcAg疫苗：在HBV复制得到控制的CHB病例中，HBcAg特异性CTLs水平显著升高，因此基于HBcAg的疫苗有望用于治疗CHB。含有HBcAg aa18–27和Th表位的疫苗在CHB患者中激发了低水平的CTL活性，但未能清除HBV。
HBsAg/HBcAg复合疫苗：在野生型C57BL/6小鼠和HBV转基因动物中，包含HBsAg、HBcAg和CpG佐剂的治疗性疫苗可引起强烈的HBsAg/HBcAg特异性体液免疫应答，对HBsAg的Th1/Th2应答以及对HBcAg的Th1型应答保持平衡。HBsAg/HBcAg特异性细胞免疫应答增强，可显著降低HBV转基因小鼠的血清HBsAg水平，且不导致肝损伤。HBsAg、HBcAg和佐剂ISCOMATRIXTM组成的疫苗可以在HBV转基因（HBV-Tg)小鼠中诱导多特异性和多功能T细胞，特别是HBc特异性CD8⁺ T细胞，使IFN-γ、TNF-α和IL-2产量增加。4次接种后，8只动物中有7只抗-HBs滴度超过10000 IU/L；在2次和4次接种后，HBV-Tg小鼠外周血HBV DNA减少，但没有统计学意义。HBcAg阳性肝细胞也显著减少，无明显肝损伤。
抗HBsAg抗体：抗体介导的免疫疗法已在多项临床前及临床研究中被评估，未展现出长效的HBV抑制作用。针对HBsAg的单克隆抗体（mAb E6F6）可在多种小鼠模型中有效抑制持续性HBV复制，在HBV转基因动物中显著减少HBsAg和HBV DNA，效果长达数周。在人肝嵌合小鼠模型中，E6F6不仅可以有效预防原发性HBV感染，而且可以减少被感染肝细胞的继发性HBV传播。水压动力注射建立的HBV持续复制的小鼠经过基于E6F6的免疫治疗后，抗HBV T细胞应答得以恢复。依赖Fcγ受体的吞噬作用被认为在E6F6相关的病毒免疫清除中发挥最关键的作用。
DNA疫苗：编码HBsAg和HBcAg的DNA疫苗可诱导针对这两种HBV抗原的体液免疫和细胞免疫应答。在肌肉和皮下注射疫苗后，肌细胞和抗原提呈细胞原位表达的HBsAg和HBcAg被处理并呈递给宿主免疫细胞，激活特异性B和T细胞。动物实验表明，多种方法可以提高DNA疫苗的效力，如整合免疫刺激性细胞因子、与NUCs联用、初免-加强免疫方案、电穿孔递送、检查点阻断等。
基于病毒载体的疫苗：多项研究表明，基于病毒载体（如水泡性口炎病毒，VSV）的疫苗在诱导T细胞方面优于其他类型的疫苗。
总而言之，目前可用的疫苗在临床前或临床研究中收效甚微。如何将活化的免疫细胞募集到肝脏中，并在肝脏中维持和增强HBV特异性免疫，仍是需要克服的难题。
（2）HBV特异性T细胞疗法：
DC疫苗：DC细胞是最强大的抗原提呈细胞，在固有免疫与适应性免疫之间发挥重要作用。在免疫移植实验中，髓样DCs（mDCs）能够调节HBV特异性CD8⁺ T细胞的功能分化。CD40刺激mDCs可恢复T细胞功能。在HBV转基因小鼠模型中，HBsAg激发的DCs可以诱导HBsAg特异性免疫应答；HBcAg激发的DCs诱导HBsAg和HBcAg特异性T细胞应答，从而导致HBsAg丢失与抗-HBs血清学转换。
CIK/DC-CIK：细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞是通过用IFN-γ、抗CD3抗体、IL-1和IL-2离体处理PBMC或脐带血单核细胞产生的，兼具T和NK细胞样表型（CD3⁺ CD56⁺）。CIK细胞以MHC限制性和非限制性方式靶向被感染细胞和癌细胞，诱导快速和普遍的免疫反应。DC-CIK指CIK细胞与DC细胞共培养，或自体DCs和CIKs的序贯过继转移。DCs（尤其是抗原激发的DCs）可以刺激NK细胞并启动抗原特异性T和B细胞应答。越来越多的证据表明，DCs的加入可以减少CIK细胞培养中的调节性T细胞的数量，并增加CD3⁺ CD56⁺细胞比例。
免疫检查点抑制剂：免疫检查点（如PD-1/PD-L1信号通路）的阻断剂可以减轻特异性T细胞的负性调节作用，或者复苏耗竭的T细胞。近期的一项离体研究表明，使用OX40刺激联合PD-1通路阻断剂可增强HBV特异性CD4⁺ T细胞的功能。在HBV携带者中，PD-1阻断剂可恢复病毒特异性的CD8⁺ T细胞；其它检查点分子（如Tim-3和CTLA-4）的阻断剂也可恢复CHB患者病毒特异性CD8⁺ T细胞应答。
基因编辑的T细胞（CAR/TCR-T）：CHB患者因为不同的免疫耐受机制，缺乏有效的T细胞应答以清除病毒。目前基于T细胞的疗法使用功能良好的T细胞库取代或增强宿主体内低能或耗竭的T细胞库，并靶向病毒特异性免疫优势表位，有望长效控制HBV感染。但这种疗法也存在着一些问题，如T细胞介导的强大杀伤作用可能导致严重的肝损伤和急性肝衰竭；以及需要证明工程化的T细胞功能得到改善，且在肝脏的免疫耐受条件下仍可保持功能。
改造的CAR-T细胞可以非MHC依赖的方式识别抗原，与天然T细胞相比有着更为广阔的靶点。Bohne等研发出靶向HBsAg的CAR-T细胞，针对HBsAg的“a”决定簇和preS1蛋白的aa37-43，识别HBsAg阳性的人原代肝细胞和HepG2.2.15细胞，并特异性清除被HBV感染的靶细胞。HBV-TCR-T细胞、HBsAg-CAR-T细胞等正处于细胞/动物实验中。
图4. 诱导HBV特异性免疫应答和重新控制HBV感染的策略。
03
当前基于免疫疗法的临床试验
已有多种免疫疗法投入动物实验，但只有部分进入了临床试验阶段。一些疗法在土拨鼠模型中发挥了作用，但在慢乙肝患者身上却未能奏效。
表1. 基于免疫疗法的现有临床研究。
GS-4774是基于酵母菌的重组疫苗，包含HBV特异性抗原（如HBx蛋白和HBsAg大蛋白）。GS-4774的安全性、耐受性和免疫原性已在健康受试者中得到验证，但在Ⅱ期临床试验中，GS-4774未能抑制CHB患者体内的病毒，HBsAg未显著减少。总之，尽管GS-4774能够刺激宿主CD8⁺ T细胞，但不足以控制HBV。
鼻疫苗候选药（NASVAC）由HBsAg和HBcAg组成，目前已进入III期临床随机对照试验，疗效略优于Peg-IFN，还需要进一步验证。
HBsAg-乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）复合物（YIC）已通过II期临床试验。在HBeAg阳性的CHB患者中，YIC接种组与对照组相比，HBeAg血清学转换率升高，病毒载量降低。但是，III期临床试验没有呈现出令人满意的结果。
HepTcell是包含HBV特异性T细胞表位的九种合成肽的混合物。在英国和韩国进行的I期临床试验中，向接受ETV或TDF治疗的HBeAg阴性CHB患者注射HepTcell三周，耐受良好，并能诱导针对患者体内HBV抗原的细胞免疫应答。
DNA疫苗的安全性已在I/II期临床试验中得到验证，但与NUCs联用收效甚微。在接受拉米夫定治疗的HBV携带者中，含有大部分HBV基因组和IL-12 DNA的DNA疫苗能够产生病毒学应答。携带HBsAg、HBcAg和聚合酶（TG1050）的非复制型腺病毒载体在小鼠模型中展现出强烈的HBV多特异性和T细胞应答延长的特点。一项Ib期研究证明了TG1050的安全性和免疫原性，有望在将来与抗病毒药物联用。
抗PD-1抗体Nivolumab单抗已进入Ib期研究，单独给予Nivolumab单抗或与GS-4774联用均可以在12周降低HBsAg水平。
目前有多种口服TLR-7/8激动剂正在进行临床试验，包括GS-9620、RO7020531、RG7795（ANA773）、RG7854、JNJ-4964（AL-034/TQ-A3334）和GS-9688。GS-9620的安全性已经得到了验证，但GS-9620并不能显著降低HBsAg水平，其疗效还有待进一步评估。TLR-7激动剂RO7020531正处于I期临床试验之中。
AIC649是已获得专利的灭活副痘病毒（iPPVO），可以诱导对非相关病原体的、自然自限的免疫反应。使用AIC649后，即便停药，土拨鼠模型体内的WHsAg也显著减少。
此外，DC/DC-CIK也已经投入了临床研究，但还需要更多的随机对照研究来验证其疗效。
总之，基于免疫疗法的临床试验尚未取得令人满意的结果，免疫疗法不仅需要诱导适应性免疫，还需要克服病毒慢性感染过程中的负性免疫调节。
04
基于IFN-α的免疫疗法
PEG-IFN-α具有抗病毒和免疫调节作用，仍然是治疗CHB患者最有效的药物。PEG-IFN-α会促进HBsAg的丢失，尤其是在给予NUCs且HBsAg滴度小于1000 IU/mL的患者中。若将Peg-IFN-α多样化地整合到多种药物方案中，例如降低剂量或间歇使用以避免严重的不良反应，则可能对HBV感染的治疗作出重要贡献。
Peg-IFN-λ是一种III型IFN，被认为对CHB的固有免疫和适应性免疫具有双重的免疫调节作用。IFN-λ与IFN-α具有相似的ISG诱导途径，抗病毒作用相似。因为IFN-λ结合的干扰素受体被限制在上皮来源的细胞（如肝细胞），预期PEG-IFN-λ的耐受性可能会优于PEG-IFN-α。
图5. HBV生命周期及抗HBV相关ISGs的作用阶段。
【引自杨舒雅,向宽辉.乙型肝炎病毒感染与干扰素介导的固有免疫应答的研究进展[J].中国病毒病杂志,2019,9(04):303-310.】
总结
慢性HBV感染被认为是HBV特异性免疫耐受的结果。因此打破免疫耐受并恢复HBV特异性免疫反应有助于患者控制和清除HBV。但到目前为止，基于该策略的尝试效果并不理想，还存在肝损伤的风险。因此，未来需要将有效的抗病毒治疗和精心设计的免疫调节相结合。
近几年对HBV特异性T细胞介导的抗病毒作用研究较多，B细胞和NK细胞也还需要更多的关注。多种宿主基因决定因素有助于抑制HBV，如UBE2L3基因可通过控制cccDNA稳定性和未知过程调节HBV复制。
cccDNA和/或整合的HBV DNA在肝细胞中对于HBV慢性感染的“功能性治愈”具有重要影响。免疫疗法有可能清除大部分具有cccDNA和/或整合HBV DNA的感染肝细胞，从而降低肝癌发生发的风险。
Seminar: “Immunobiology of Chronic Hepatitis B” Mala Maini PhD FRCP FMedSci
文献来源：
Meng Z, Chen Y, Lu M. Advances in Targeting the Innate and Adaptive Immune Systems to Cure Chronic Hepatitis B Virus Infection. Front Immunol. 2020;10:3127. Published 2020 Feb 7. doi:10.3389/fimmu.2019.03127
