荧光定量PCR实验方法

荧光定量PCR是科研过程中不可缺少的一种实验手段。番茄君还记得自己第一次做荧光定量PCR时，面对着96孔板甚至是384孔板时，十分紧张。即使提前很久计划好了该怎么加样，但是当看到密密麻麻的孔时，还是生怕点错。在加样的过程中，更是小心翼翼，一度怀疑自己。

今天番茄君结合自己的亲身经历，给大家分享一下番茄君在做荧光定量PCR时是如何加样的。

 

下图是一个96孔板，从上到下依次为A，B，C，D，E，F，G，H，从左到右依次为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。一般做荧光定量PCR时，要求三个生物学重复，三个技术重复。现在我们假设有对照组的3个cDNA样品和处理组的3个cDNA样品，一共6个cDNA样品。我们要检测三个目的基因a，b，c的表达量，加上内参基因，一共有四个基因。这样的话，我们需要6（个cDNA）*4(个基因)*3（个重复）=72个孔。每个孔按10ul的PCR体系，即cDNA 1ul，上下游引物各0.5ul，水3ul，SYBR 5ul。

加样前的规划

 

我们按照如下思路加样，如下图所示，每一个红色框里是同一个cDNA（即A1-D3, A4-D6, A7-D9为对照组的3个cDNA，E1-H3, E4-H6, E7-H9为处理组的3个cDNA）。此外，A1-A9和 E1-E9是内参基因，B1-B9和 F1-F9是a基因，C1-C9和 G1-G9是b基因，D1-D9和 H1-H9是c基因。

准备试剂

 

将荧光定量PCR所需要的试剂cDNA, 上下游引物，水，SYBR等准备好。

 

混合cDNA, 水，SYBR

 

根据上面的加样思路，每个红色框里的cDNA，水，SYBR是一样的，同一个cDNA需要加12个孔，我们按照15个孔计算。准备一个EP管，加入cDNA 1μL*15=15μL，水3μL*15=45μL, SYBR 5μL*15=75μL。充分混合均匀，然后每个孔中分别加入9ul混合物。其他红色框同样按上述方法加好。

 

混合引物

 

每对引物需要加18个孔（A1-A9,E1-E9），我们按照22个孔计算，先在一个EP管中加好上下游引物各0.5μL*22=11ul，充分混合均匀，然后在A1-A9和E1-E9中各加入1ul。其余引物同样按上述方法加好。

 

这样加样就完成了，然后贴膜，离心（一定要离心，一定要离心，一定要离心，重要的是说三遍），上机。

 

其实加样方法多种多样，比如也可以先将引物，水，SYBR混合好后点样，再点cDNA（这样的方法适合于cDNA样品比较少的情况）。每个人都有不同的实验习惯，最重要的是做实验之前一定要计划好，做实验的过程中要集中注意力，不要受外界干扰。