先看题目
这是一篇发表在Cell Proliferation上的文章，最新影响因子为5.753:
我们先一起看一下题目：LncRNA NEAT1 promotes the tumorigenesis of colorectal cancer by sponging miR‐193a‐3p，LncRNA NEAT1通过miR-193a-3p 海绵作用促进大肠癌的发生。我们来拆解下题目，疾病是colorectal cancer，主变量是LncRNA NEAT1，表型是tumorigenesis，次变量是miR‐193a‐3p。
先说一下什么是miRNA海绵作用，简单理解就是miRNA的inhibitor抑制剂，这里我们可以猜测是LncRNA NEAT1发挥了miRNA海绵作用结合miR-193a-3p，影响了miR-193a-3p对下游癌基因的抑制作用，促进了大肠癌的发生，也就是一个ceRNA的套路。我们可以大概猜一下会有哪些内容，完整的一套内容应该是这样：
1：LncRNA在肿瘤中高表达（表达差异，生信分析）
2：LncRNA的研究价值（表型相关，预后相关，生信分析+实验）
3：找下游miRNA（数据库预测+实验）
4：LncRNA上下调检测编码基因表达（实验）
5：miRNA抑制LncRNA和编码基因（实验）
6：Rescue设计：分别进行主变量和次变量的rescue实验（实验）
7：RIP：过表达LncRNA后进行RNA免疫共沉淀（实验）
但是，考虑到这个文章是一个5.5分的文章，并且题目并不涉及到下游编码基因mRNA，所以上面这一套结果中涉及mRNA部分可以不做，直接机制的RIP部分也可以没有。我们先猜测到这里，接下来看看文章。
拆解内容
Figure 1
▲Figure 1：LncRNA NEAT1在CRC组织中表达上调，并与较差的生存和复发有关
1A图和1B图做的是差异分析的内容，使用TCGA的数据对NEAT1进行差异表达分析，结果发现NEAT1在CRC组织中表达更高，1C图作者联合TCGA中NEAT1的表达数据和预后数据，使用截断法找到高低表达组的最佳cut-off值，并且以这个cut-off值进行生存分析，得到1D图和1E图（一般我们做生存分析会使用中位值，这里使用生信算法找到cut-off值是另一种方法）。结果发现， NEAT1高表达的大肠癌患者的生存期更短，肿瘤复发率更高，并且早、晚期NEAT1高表达患者生存期均较短。
对于LncRNA的研究，LncRNA丰度高是一个前提条件，表达差异必不可少，而检测预后也能直接将分子的研究价值往临床上面靠，使用数据库的优势在于性价比高，即使你不会代码，也能使用各种生信在线工具进行分析，简单方便快捷。
Figure 2
▲ Figure 2：NEAT1促进CRC癌细胞生长
作者认为NEAT1在大肠癌组织中的表达增加，提示其在大肠癌中具有促癌作用，接下来作者就做了一系列的表型实验。先使用qRT-PCR 检测NEAT1在不同CRC细胞系中的表达（2A），发现NEAT1在SW480细胞系中的表达低于正常结肠组织，而在LOVO和HCT116细胞系中的表达高于正常结肠组织，那么接下来就使用SW480、LOVO和HCT116三个细胞系进行研究，在高表达细胞系中进行敲低，在低表达细胞系中进行过表达（2B），进一步分析发现，NEAT1基因敲除降低了LOVO和HCT116细胞系的细胞存活率(2C)，而在SW480细胞中过表达NEAT1起到了促进细胞增殖的作用（2D）。对LOVO和HCT116进行sh-NEAT1转染，发现细胞集落形成数明显低于空载体，而过表达NEAT1则增加了SW480细胞的集落形成数（2E和2F）。
Figure 3
▲Figure 3：LncRNA NEAT1促进CRC细胞的侵袭
Figure 3还是表型实验，这回是侵袭（还记得在干湿结合第一篇推文说的表型“三件套”吗？）。为了观察NEAT1对CRC细胞侵袭能力的影响，作者进行了Transwell实验，结果显示NEAT1基因的敲除减弱了LOVO和HCT116细胞的侵袭能力，而在SW480细胞中过表达则促进了这些作用（3A）。接着又是一个表型——EMT，作者使用Western blotting检测EMT上皮-间充质转化的标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达，发现NEAT1基因敲除后，LOVO和HCT116细胞中E-cadherin的蛋白表达增加，N-cadherin和Vimentin的表达降低。反之，NEAT1过表达降低了SW480细胞株E-cadherin的表达，而增加了N-cadherin和Vimentin的表达（3B）。
Figure 4
▲ Figure 4：在大肠癌细胞中，lncRNA NEAT1作为miR-193a的海绵
前面作者一通分析找到了NEAT1的研究价值，又进行了平行表型实验，到了这里，才开始了文章最重要的部分——NEAT1结合miR-193a。要证明NEAT1可以结合miRNA，首先应该找到miRNA，作者使用starbase和miRcode两个数据库预测NEAT1的靶标miRNA，结果发现刚好只有2个（数据库那么多，为什么只选这两个呢？你懂的），作者接着要从2个miRNA中找到确定的那一个靶分子，如果NEAT1发挥了miRNA海绵功能，那么NEAT1和靶分子之间应该是负相关，所以作者接着对两个靶分子进行表达检测，并且与NEAT1表达量进行了相关性分析，结果发现，大肠癌组织中miR-193a表达下调，miR-107表达上调(4B)，NEAT1与miR-193a表达呈负相关，与miR-107表达无相关性(4C)。此外，NEAT1降低miR-193a的表达(4D)，那接着要做什么呢？找结合位点对吧？所以4E就是miR-193a与野生型(Wt)或突变型(Mut)NEAT1的结合位点。找位点还不够，得验证啊，为了进一步证实NEAT1是miR-193a的靶点，作者进行了luciferase实验，结果表明miR-193a mimic降低了WT NEAT1的荧光素酶活性（4F），作者这里还来了一个给文章加分的实验——在LOVO和HCT116细胞系中进行了RIP实验，使用抗Ago2抗体进行免疫沉淀后，NEAT1和miR-193a都富集增加（4G）
Figure 5
▲ Figure 5：在CRC中，NEAT1基因敲除可抵消miR-193a抑制剂的促瘤作用
这个图展示的是Rescue实验，NEAT1发挥miR-193a的海绵作用，那么rescue的设计应该是敲低NEAT1的同时抑制miR-193a。作者将miR-193a抑制剂和sh-NEAT1共转染到LOVO和HCT116细胞，结果表明miR-193a抑制剂促进了细胞增殖和侵袭能力，而敲低NEAT1则抵消了miR-193a抑制剂诱导的促肿瘤作用(5A，5B)，这里Rescue只做了敲低。上游的lncRNA-miRNA做完了，下面还需要做什么？往下游找那就是编码基因mRNA，作者发现以往研究表明IL17RD是miR-193a的直接靶点，并且TargetScan也预测到IL17RD和miR-193a的结合，因此在本文中，miRNA-mRNA部分并不算创新，这时候可以直接做mRNA的rescue实验，证明NEAT1和miR-193a之间的依赖关系。那作者是不是这么做呢？作者先利用TCGA数据分析了IL17RD在CRC中的表达，结果发现IL17RD在大肠癌中的表达明显上调(5C)，并与miR-193a在CRC中的表达呈负相关(5D)。为了揭示NEAT1与IL17RD的直接关系，作者将shNEAT1转染LOVO和HCT116大肠癌细胞系，并将NEAT1过表达载体转染SW480细胞系，qRT-PCR和Western blot分析(5E)显示，敲低NEAT1下调了IL17RD的表达。同时，作者做了miR-193a抑制剂与sh-NEAT1共转染对IL1RD表达的影响，发现miR-193a抑制剂可上调IL17RD的表达，而NEAT1基因的敲除可减弱miR-193a抑制剂诱导的IL1RD表达的增加。（有没感觉哪里怪怪的？）
Figure 6
▲ Figure 6：敲低NEAT1对异种移植瘤生长的抑制作用
接下来作者来了一个动物实验，在体外研究了NEAT1对CRC细胞的促瘤作用后，进一步检测了它在体内的作用。作者建立皮下移植瘤模型，观察NEAT1敲除对肿瘤生长活性的影响，结果发现NEAT1基因敲除降低了肿瘤的增殖率(6A，6B)，sh-NEAT1组的平均体积和重量均较sh-NC组减小(6C，6D)。从sh-NEAT1组和sh-NC组的肿瘤组织中提取RNA和蛋白质，qRT-PCR检测NEAT1和miR-193a的表达水平，Western blot检测PCNA的表达水平，结果表明sh-NEAT1组与sh-NC组相比，NEAT1的表达降低(6E)，miR-193a的表达增加(6F)，这表明NEAT1基因的敲除下调了PCNA在肿瘤组织中的表达。(PCNA是肿瘤增殖表型的marker)
小结
这样，整个文章就全部结束啦！相比较前面的干湿结合文章，这个文章更加符合我心目中干湿结合文章的样子，生信分析与实验相结合，整个文章环环相扣，细胞、组织、动物、生信四个维度齐全，多角度全方位对文章观点进行论证，RIP实验和Rescue实验是文章能够上5分的一个关键，然而美中不足的是作者在下游编码基因环节创新性不够，并且对Rescue的设计进行了精简，总的来说文章有点浪费，补齐实验完善逻辑的情况下，文章应该能够再上一个档次，IF往上提个1-2分应该没问题，要是再在主变量的创新上下功夫，比如外泌体来源的LncRNA？那应该就是10+的故事了，而且这图实在是……略丑！我们下期见！O(∩_∩)O
