而lncRNA红火至今，也是因为它与DNA、RNA、蛋白质均有着千丝万缕的关系。其中，lncRNA-蛋白的互作关系更是成为了科研者们聚焦的热点。
如今就分享一篇发表于Oncogene（IF=7.971）的lncRNA-蛋白互作文章，让我们一起围观高手怎么戏耍lncRNA小怪物的。
题目四要素
主变量：NORAD（lnc RNA）
因变量：上游YAP pathway(YAP / TAZ-TEAD复合物)，下游效应变量S100P（蛋白）
疾病：肺癌、乳腺癌
表型：转移
结合摘要做出科学假设：在肺癌、乳腺癌中，YAP抑制NORAD，后者通过结合S100P抑制肿瘤转移。
假设逻辑
1. 表达差异：临床样本检测肿瘤患者与对照组NORAD表达水平
2. 正反回复：上调、下调NORAD，NORAD与S100P反反反/反正正回复，观察表型
3. 细胞动物：in vitro & in vivo
4. 分子交互：主变量NORAD与S100P的直接作用机制
数据解构
Fig1：NORAD expression in lung and breast cancer patients and the correlation of NORAD expression with prognosis
1A、B：肺癌、乳癌中NORAD的表达
1C：NORAD在配对非肿瘤-肿瘤肺组织中的表达
1D、E：KM生存曲线评估NORAD表达与肺癌和乳癌患者生存率的关系
1f、g：肺癌和乳癌中NORAD表达与淋巴结转移的关系
总结：肺癌、乳癌中NORAD低表达，与淋巴结转移和低生存时间相关
Fig2：NORAD is repressed by the YAP/TAZ pathway
（1）探索NORAD低表达的机制：UCSC Genome Browser发现TEAD4调节NORAD的5’结构区；
2A：shRNA、siRNA干扰TEAD1/3/可增加NORAD的表达；
2B：敲减TEAD1/3/可增加NORAD的表达
2C、D：P17和维替泊芬干扰TEAD与YAP/TAZ的结合也可同样增加NORAD的表达
2E-G：同时降低YAP和TAZ可增强NORAD表达和NORAD启动子活性
（2）NORAD是否是YAP/TAZ-TEAD的直接靶标：PROMO program预测了6个可能的TEAD4与NORAD启动子结合位点；
2G-I：片段分析定位直接结合位点
2J、K：ChIP确认TEAD4被招募到NORAD启动子中，YAP/TAZ和NuRD复合体的组件(CHD4、MTA1)均被募集到NORAD启动子的同一区域，TEAD1 / 3/4敲减可取消招募
总结：loss of function 论证上游因变量与主变量调控关系；片段分析与ChIP验证结合位点
Fig3：NORAD suppresses migration and invasion and its downregulation contributes to the migration and invasion effects of the YAP pathway.
3A：RT-qPCR检测NORAD基础表达
3B、C：NORAD过表达降低CL1-5的迁移和侵袭能力，NORAD低表达促进CL1 – 1的迁移和侵袭、示shRNA干扰NORAD表达的效率
3D、E：YAP 8SA转染检测CL1-5、Hs578细胞系转移和侵袭能力
3F：TAZ shRNA, YAP shRNA, NORAD shRNA干扰的H460细胞系转移和侵袭能力
总结：主变量NORAD、上游因变量YAP/TAZ与表型调控的一正一反论证、主变量与上游因变量的反反反回复验证
Fig4：NORAD binds S100P through its multiple repeated units.
4A：RNA-pulldown，孵育过表达的GFP-S100P的293T细胞裂解液与生物素化NORAD片段、反义RNA，
4B：RNA-pulldown，孵育细菌纯化的GST-S100P或GST与生物素化的NORAD U7片段、反义RNA
4C-E：RNA-pulldown，孵育细菌纯化的GST-S100P与各种生物素化的NORAD片段
4F、G：RIP，检测H460和ZR75细胞系中S100P抗体或对照IgG回收的靶RNA
总结：RNA pulldown、RIP检测细胞内NORAD与S100P的直接结合位点
Fig5：NORAD antagonizes S100P.
5A、B：H100和ZR75稳定株中S100P与IQGAP1和p53结合的免疫沉淀分析
5C、E：WB检测H460、MDA-MB-231细胞系Cathepsin D、Cofilin P、Cofilin、GAPDH蛋白表达
5D：免疫沉淀分析MDA-MB-231稳定株中S100P与IQGAP1、p53的结合
总结：主变量与下游因变量S100P的一正一反调控关系
Fig6：S100P mediates the effects of YAP/NORAD axis on migration and invasion.
6A：表达NORAD shRNA、S100P shRNA的H460细胞的迁移和侵袭能力
6B：表达NORAD、S100P的CL1-5细胞的迁移和侵袭能力
6C：H460 v.s 敲除S100P、表达NORAD shRNA 的H460细胞系迁移和侵袭能力
6D：瞬时转染YAP 8SA的H460细胞系v.s 敲除S100P的H460细胞系的迁移和侵袭能力6e：瞬时转染野生型和突变型mini-NORAD的H460细胞的迁移和侵袭能力
总结：反反反Rescue验证NORAD与S100P调控关系的必要性
Fig7：S100P sequestration mediates the suppressive effect of NORAD on lung and breast cancer metastasis.
7A、 C：生物荧光示NORAD、S100P与shNORAD、shS100P肺转移
7B、D：第35、42天的肺转移和肺组织切片，散点图计数肺表面转移性结节数目
总结：动物模型验证NORAD与S100P对转移表型的作用
Fig8：YAP / TAZ-TEAD复合物与NuRD复合物一起抑制NORAD转录的模式图以及NORAD在结合S100P以抑制肿瘤转移中的功能
总结：正常细胞中NORAD表达，抑制转移；肿瘤细胞中YAP / TAZ-TEAD复合物与NuRD复合物抑制NORAD转录，促进转移
套路总结
单变量论证：NORAD→细胞转移、侵袭
1. 表达差异：组织(Fig1)
2. 正反回复：一正一反(Fig3)
3. 细胞动物：动物维度含下游机制验证(Fig7)
调控关系论证：YAP/TAZ→NORAD、NORAD→S100P
1. YAP/TAZ调控NORAD：直接位点&正反调控(Fig2)、Rescue(Fig3)
2. NORAD-表型：(Fig3)
3. YAP/TAZ-表型：(Fig3)
4. NORAD调控S100P：直接位点&正反调控(Fig4、5)、Rescue(Fig6)
二元交互论证：YAP/TAZ→NORAD 、NORAD-S100P(RNA-蛋白交互)
1. 筛未知：1）由已知的NORAD通过 UCSC Genome Browser寻找到上游YAP/TAZ-TEAD complex；2）GO富集分析NORAD互作蛋白，选择促转移的S100P
2. 有结合：1）证实NORAD与TEAD1/3/4有结合：shRNA、siRNA、luciferase reporter、P17、维替泊芬多种手段验证；2）证实NORAD与S100P有结合：RNA pulldown 实验
3. 有区域：1）PROMO program预测TEAD与NORAD的结合位点，分段验证+ChIP；2）分段验证+位点突变+RIP确定NORAD与S100P的结合位点
4. 下游效应：1）TEAD与NORAD启动子结合并募集YAP / TAZ和NuRD复合体以抑制NORAD转录；2）NORAD过表达抑制S100P的促肿瘤效应
知识点总结：1.NORAD在肺癌、乳癌中低表达，与淋巴结转移和不良预后相关
2. YAP/TAZ促进肿瘤效应，明星Hippo通路YAP/TAZ-TEAD复合物与NuRD复合物结合，在转录水平抑制NORAD表达；后者作为多价结合平台结合促转移蛋白S100P，抑制转移
3.S100P，S100钙结合蛋白家族一员，在多种癌系高表达，与不良预后相关；S100P通过控制肌动蛋白细胞骨架动力学和细胞外基质重塑调控靶蛋白，包括IQGAP1、Ezrin、肌球蛋白IIA、组织蛋白酶D和磷酸化的cofilin；S100P还可通过结合和灭活p53来增强化疗耐药性
文章评析
1.创新维度：主变量NORAD并非全新发现，Pubmed可检索到100+条目，与肿瘤的增殖表型也并非首次提出；但与上游YAP、下游S100P均为全新发现，且一口气证明了直接作用位点。
2.逻辑维度：本篇文章为如假包换的三元变量(围绕主变量的上下游)，两组两两交互论证采用数据库预测位点+实验验证策略，工作量到位。
3.数据维度：挖掘TCGA、GEO数据库作为临床数据来源，细胞动物实验具备， 补充图表丰富.
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41388-019-0812-8#Fig2
