在慢性HBV感染者血清中能够检测到HBV RNA，但目前对这些RNA的具体分子特征仍有争议。我们实验室最早提出HBV RNA病毒样颗粒中的HBV RNA多为未启动或未完成逆转录的pgRNA以及其剪接变异体【1】，并且由于P蛋白的RNase H活性，这些pgRNA的3’端往往是截短的。最近，来自Fabien Zoulim 实验室的Bernd Stadelmayer及其同事采用HBV full-length 5’RACE (rapid amplification of cDNA ends)技术，证实了外泌的HBV RNA病毒样颗粒除了全长的pgRNA外，也有剪接变异体（splicing variants）的存在【2】，这一结果与我们实验室的推测相契合。
作为反映肝组织内cccDNA存在及其转录活性的血清病毒学标志物，我们进而提出HBV RNA可以作为监测核苷（酸）类药物（NAs）治疗下血清HBV DNA检测阴性慢乙肝患者病毒状况的血清病毒学新指标【3,4】。为明确NAs治疗下血清HBV RNA的存在形式，我们实验室曾开展了一系列的研究。首先，我们通过靶向pgRNA 的preC/C区、S区和X区（对应pgRNA 5’端、中段和3’端逆转录起始区）的qPCR检测，对循环血中HBV RNA的形式及其随NAs治疗的变化进行研究，证实了NAs治疗下循环血中的HBV RNA为3’端缺如的pgRNA，并存在高丰度的剪接变异体【5】。继而，在后续实验中我们发现，靶向preC/C区、S区和X区的HBV RNA定量水平依次递减。这样的递减顺序与逆转录合成rcDNA负链过程中作为模板的pgRNA被P蛋白的RNase H活性逐步降解的方向相一致。通过检测preC/C区、S区和X区3个不同区域HBV DNA的水平及其变化的差异，我们从另一个方向印证了上述靶向不同区域的HBV RNA存在差异的事实【6】。进一步，我们讨论了NAs治疗下pgRNA 3’端截短及剪接体变异对靶向不同区域的PCR引物及TaqMan探针设计在循环血中pgRNA定量检测的影响，并建议尽量选择preC区作为检测区域，以尽量避免常见的剪接变异带来定量的不准确性，影响对cccDNA转录活性的判定。
Northern Blot 结果来自参考文献doi: 10.1002/hep.30844；doi:10.1016/j.jhep.2017.10.030，结果C修改自参考文献doi: 10.1128/AAC.00680-17。
下面同学们介绍的Mark Anderson等的这篇文章【7】，通过对HBV RNA Core基因区和X基因区双通道TaqMan探针法qPCR检测，定量分析了1827例患者循环血样本中的RNA不同区域水平，并依据两种定量检测所确定的HBV RNA水平相近，推测NAs治疗下血清中HBV RNA的主要组分是全长的前基因组RNA（pgRNA）。然而，对其数据的细致分析发现，在其相当数量的患者样本中，靶向Core区所检测到的HBV RNA总是要比靶向X基因区高数倍之多。这些结果提示：1. 在其检测样本中可能存在因被P蛋白的RNase H活性降解所形成的pgRNA 3’端截短体，以至于靶向X基因区的HBV RNA水平偏低；2. 不排除其Core区的下游引物受NAs治疗下pgRNA剪接变异增加带来的影响，使其与靶向X基因区的HBV RNA水平差异缩小。理论上讲，这种影响会缩小其与X定量的差异，由此得出的 NAs治疗的慢性乙肝患者循环血中存在的HBV RNA主要为全长的pgRNA的推论值得商榷。由于核衣壳的形成需要P蛋白与pgRNA的结合，我们赞同该文的另一观点，即循环血中的HBV RNA少有2.4 kb、2.1 kb(大、中、小HBsAg的mRNA)及0.7 kb（X蛋白的mRNA）等转录本存在。至于另一3.5 kb的preC 转录本（HBeAg的mRNA，与pgRNA一样含有能与P蛋白结合的5’端ɛ结构）何以很少被核衣壳所包裹，是一个非常值得深入研究的课题。
我们的“片警实验室”公众号近期介绍了牛津大学实验心理学系发展神经心理学教授Dorothy Bishop发表在Nature杂志的一篇名为“How scientist can stop fooling themselves”的文章。文中提到，当我们面对新的数据时，我们都倾向于忽略那些与我们的观点相矛盾的证据，而人性的认知偏见（已存在于我们大脑中的想法）会诱导我们看到那些并不存在的结果。
血清HBV RNA作为新的反映肝组织cccDNA存在及转录活性的新指标，在相当长的时间内人们会对其来源、分子特征及临床意义争议不断。但我们相信，我国新版的《慢性乙型肝炎防治指南》（2019版）将之写入，必将广泛促进对该指标的机制研究和更多临床应用的进一步探索。
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是感染性肝脏疾病的主要病因，并在全球范围内造成了约2.57亿人慢性感染，每年因此死亡的人数达到78.6万。在HBV的复制周期中，位于感染细胞细胞核内的病毒共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）转录成多种mRNA，其中就包括了全长(超过病毒基因组)的前基因组RNA（pregenomic RNA， pgRNA）。pgRNA被包裹进由病毒核心蛋白组装的衣壳中，并在病毒HBV DNA聚合酶（polymerase，P蛋白）作用下反转录为rcDNA。最近，已经有多篇文献表明慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者血清中除了HBV DNA外，还可以检测到pgRNA。在未经治疗的患者中，pgRNA水平约比HBV DNA水平低1.7±0.71 log左右。长期的核苷（酸）类药物（nucleos(t)ide analogues，NA）抗病毒治疗是CHB患者治疗方案之一，其药物包括有恩替卡韦（entecavir）、替诺福韦（tenofovir）等。核苷（酸）类药物（NA）作用于病毒的反转录过程，能够显著降低血清病毒DNA载量。但是NA不能直接影响cccDNA的稳定性或转录活性，也不能阻断pgRNA病毒样颗粒的包装和分泌，因此NA治疗的CHB患者常带有高水平的pgRNA，这反映出患者肝组织中cccDNA仍处于转录活跃状态。
有学者提出将患者血清pgRNA定量作为监测cccDNA功能状态的非侵入性手段，并用于监测NA治疗效果。为此，文章作者的前期研究报道了一种双荧光通道qPCR方法用于同时定量检测HBV感染患者血清中HBV Core基因区和X基因区的RNA水平。他们的研究结果显示，该方法在无论有无NA治疗的急性和慢性乙型肝炎患者血清pgRNA检测中均表现出了极佳的检测效果，且Core基因区和X基因区定量水平表现出了极高的一致性。目前，在血清中观察到的HBV RNA类型还包括HBV RNA剪接变异体，X基因mRNA以及其它种类HBV RNA等，这提示含HBV RNA的病毒颗粒中可能包含复杂多样的RNA。这让作者提出这样一个问题，在其开展的pgRNA研究中是否有各种HBV RNA变异体存在。在该文中，通过双荧光通道方法，作者检测了一个更大的NA治疗的CHB患者队列中pgRNA的Core基因区和X基因区RNA水平，来尝试回答这个问题。
结果
通过对684名患者（共1827例样本）的基线及NA治疗不同时间点纵向队列血清中的981例RNA水平处于定量线性范围之内的样本进行Core基因区和X基因区（引物靶点见图1A）的RNA水平定量检测结果显示，Core区RNA水平处于1.81-8.91 log₁₀ U/mL之间，X区RNA水平处于1.67-8.54 log₁₀ U/mL之间，相关性分析显示二者之间具有很强的线性关系 (R² = 0.960)。由于所测两个靶点的HBV RNA水平相似，作者认为该结果提示检测到的血清HBV RNA为全长的pgRNA（图1B）。Bland-Altman分析（常用于评价连续变量的一致性）也表明Core区和X区RNA水平具有良好的一致性（95%置信区间介于-0.517至0.889 log₁₀ U/mL，Core区偏倚值为0.19 log₁₀ U/mL）（图1C）。
在这981例样本中，有22例样本Core区和X区RNA水平差异大于±1 log₁₀ U/mL。对其中15例血样足够的样本，用原始引物及一对额外的Core区引物对这些样品进行重新检测时发现，其中 9份(60%)不再有Core区和X区RNA水平差异大于±1 log₁₀ U/mL，这说明观察到的差异可能是由仪器运行误差或者Core区基因突变造成的(图1D&E)。在Core区和X区RNA水平差异仍然大于±1 log₁₀ U/mL的6例样本中，有3例来自同一位个患者，提示Core区基因突变会影响引物与模板的结合（注：文中未见相关突变检测信息）。其余3例样本的X区RNA始终处于较低水平，这提示突变影响了X区引物与模板结合。纳入复测样本后，981例NA治疗患者样本中有968例(98.7%)的Core区和X区RNA水平差异小于±1 log₁₀ U/mL，这说明患者血清中检测到的RNA主要为全长的pgRNA。
图1 慢乙肝患者血清HBV Core区和X区RNA定量水平的比较。
总结
该研究提供了一个NA治疗下的大型CHB患者队列的Core基因区和X基因区定量数据。既往研究中报道，HBV衣壳内的RNA主要为全长pgRNA，几乎没有检测到短于pgRNA的其他种类RNA。这与之前的报道的通过数字PCR证实的血清中全长pgRNA水平为precore RNA的200倍以上的结果相一致。然而新近的研究提示，在CHB患者的血清中，除了pgRNA外，还有 HBV RNA剪接变异体，编码HBx蛋白的mRNA以及更小的RNA片段的存在。此文通过对pgRNA检测进行设计，分别针对pgRNA两端的Core基因区和X基因区进行检测，如果在血清HBV RNA中有其他种类的RNA占据了较高的比例，那么Core基因区和X基因区的定量结果应当有较大差异。然而，即使在接近定量检测下限的范围，Core和X的定量结果仍然表现出了极强的一致性。如果剪接变异体和X基因mRNA大量存在，那么检测结果应当表现出极强的Core区或X区RNA水平偏倚。然而Bland-Altman分析结果显示仅有极小的向Core区RNA水平偏倚，而作者认为这种偏倚可以通过引物的扩增效率差异来解释。值得注意的是，队列中的样本没有涵盖肝细胞癌患者（既往报道认为肝细胞癌患者血清存在高水平HBV RNA剪接变异体）。另外，在作者的结果中，HBeAg的状态对Core区和X区的定量也不存在影响。这些结果提示全长pgRNA在血清HBV RNA中占据主要地位。由于没有观察到Core区或X区RNA水平的明显偏倚，作者认为非pgRNA不可能在血清中以高水平存在。未来定量分析血清中可检测的其它种类HBV RNA与全长pgRNA的相对数量的研究将具有很大的意义。
【1】 王杰，等. J Hepatol. doi:10.1016/j.jhep.2016.05.029.
【2】 J Hepatol.doi:10.1016/j.jhep.2020.01.028.
【3】 鲁凤民，等.2016. doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2016.09.001.
【4】 鲁凤民，等.2016.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418. 2017.02.005.
【5】 王杰，等. J Hepatol. doi:10.1016/j.jhep.2017.10.030.(与窦晓光教授团队合作)
【6】 刘永振，刘慧，等. Hepatology. 2020 doi: 10.1002/hep.30844.(与魏来、郭巨涛等教授团队合作)
【7】 Clin Infect Dis. 2020 Jul 20;ciaa1015. doi: 10.1093/cid/ciaa1015.
文献来源：
Anderson M, Gersch J, Luk KC, et al. Circulating Pregenomic HBV RNA is Primarily Full-length in Chronic Hepatitis B Patients Undergoing Nucleos(t)ide Analogue Therapy [published online ahead of print, 2020 Jul 20]. Clin Infect Dis. 2020;ciaa1015. doi:10.1093/cid/ciaa1015
