一种核苷酸转移酶毒素通过使tRNA受体茎失活来抑制结核分枝杆菌生长的机制

结核病（Tuberculosis）是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的传染性疾病，每年造成至少120万人死亡【1】。与此同时，多重耐药性和广泛耐药性的结核分枝杆菌的出现大大增加了控制结核病的难度。因此，对结核分枝杆菌及其存活机制进行深入的研究，有利于开发新药和新治疗策略。毒素-抗毒素(Toxin-Antitoxin)系统广泛分布于原核生物基因组中，并已被证明能帮助细菌在噬菌体入侵、免疫应答和抗生素治疗中存活【2-6】。然而，到目前为止，对于毒素-抗毒素系统在结核分枝杆菌中的作用及其机制仍是所知甚少。

 

近日，Science Advances杂志在线发表了法国图卢兹大学Pierre Genevaux课题组与英国达勒姆大学Tim R. Blower课题组合作研究的成果“A nucleotidyltransferase toxin inhibits growth of Mycobacterium tuberculosis through inactivation of tRNA acceptor stems”。该项工作以结核分枝杆菌的四个来自DUF1814家族的核苷酸转移酶(Nucleotidyltransferase,NTase)毒素(MenT1-4)为研究对象，通过对毒素MenT3蛋白3D结构解析，结合MenT3抑制子基因的筛选和体外活性实验，首次揭示了MenT3向未负载(uncharged)tRNA的3′-CCA受体茎(acceptorstems)添加嘧啶核苷酸(CTP或UTP)的NTase活性，并揭示MenT3具有很强的底物特异性，偏好靶向45种结核分枝杆菌tRNA中的丝氨酸-tRNA(tRNASer)。

研究人员首先对四种毒素进行毒性的检测，结果表明MenT3无论在结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) 和大肠杆菌(E.coli) 中均表现出最强的毒性。随后，研究人员通过X射线晶体衍射将MenT3结构解析为1.6Å分辨率。MenT3是单体双叶球状蛋白，两个半球通过短接头连接。表面静电分析揭示出一个独特的正电表面，其中深陷的凹处包含体内毒性所需要的残基D80，K189和D211。这表明了活性位点的潜在位置，其中的正电表面可以促进与负电底物（例如核酸）的相互作用（图1）。

图1.MenT3蛋白3D结构

 

接下来，研究人员通过实验室自己构建的大肠杆菌基因文库筛选抑制MenT3毒性的抑制子基因。在这项工作中，通过了两轮筛选，研究人员从大约60000个大肠杆菌基因与毒素基因menT3共转化克隆中鉴定出18个潜在的抑制子基因，这些抑制子基因包含大肠杆菌染色体的两个不同区域，其中一个区域含有ydeA基因，编码一种l-阿拉伯糖（l-ara）转运蛋白，可降低大肠杆菌中的l-ara水平，因而不是MenT3真正意义上的抑制子。另外一个区域含有rph基因，编码核酸酶PH(RNase PH)。RNase PH能够去除tRNA前体中3′-CCA序列下游的核苷酸，有助于tRNA前体进行正常的氨酰化(aminoacylation)，从而形成相应的负载tRNA。

图2. MenT3抑制蛋白合成和tRNA氨酰化

 

由此，根据上述的MenT3毒性抑制子筛选试验的结果，研究人员猜测MenT3通过在未负载tRNA的3′-CCA末端添加核苷酸从而影响tRNA的氨酰化，进而抑制翻译过程。为了验证此猜想，研究人员首先在体外合成蛋白系统中添加纯化的MenT3，以及在体内合成蛋白过程中诱导MenT3的表达，结果显示MenT3能够抑制体外蛋白合成和体内体外tRNA的氨酰化（图2）。随后，研究人员进一步使用α-P32放射性标记的tRNA对MenT3 WT以及两个突变型MenT3(D80A)和MenT3(K189A)进行体外NTase活性的测定。在体外将MenT3 WT与大肠杆菌tRNATrp分别与四种核苷酸(GTP, ATP, UTP 和CTP)一起孵育，然后通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以tRNA大小的区别来检测核苷酸的添加与否。结果显示，在CTP或UTP存在的情况下，MenT3可以向tRNATrp添加2至3个额外的核苷酸，这表明MenT3是嘧啶特异性的NTase，而以ATP或GTP为底物未观察到类似的核苷酸的添加（图3）。此外，MenT3对具有3′-CCA基序的tRNA具有明显的特异性。

图3.MenT3向未负载tRNA的3′-CCA末端添加嘧啶核苷酸

 

最后，为了了解MenT3是否会对结核分枝杆菌的不同tRNA表现出偏好性。研究人员PCR合成了45种结核分枝杆菌tRNA的DNA模板，可以体外转录这45种tRNA，其中每个tRNA都带有3′-CCA基序。如前所述，将每个放射性标记的tRNA与MenT3和无放射性标记的CTP一起孵育。结果表明，MenT3的确是高度特异性的，优先修饰结核分枝杆菌的四个tRNASer（图3）。因此，此研究阐明了MenT3的毒性机制，表明其作为嘧啶核苷酸特异性的NTase，在体外偏好靶向结核分枝杆菌tRNASer并添加嘧啶核苷酸的功能。由此，此研究发现了一个先前未知的机制，该机制扩大了细菌毒素所利用的酶促活性的范围，从而发现了一种阻止蛋白质合成的新理论（图4）。

 

图4.MenT3作用机制示意图

 

据悉，法国图卢兹大学Pierre Genevaux教授和英国达勒姆大学Tim R.Blower教授为本文的共同通讯作者，Pierre Genevaux课题组蔡奕明博士（国家留学基金委员会-法国图卢兹大学合作奖学金）和Tim R. Blower课题组Ben Usher博士为本文共同第一作者。此项工作得到法国巴黎IBPC的Ciarán Condon课题组，图卢兹IPBS 的Olivier Neyrolles课题组和新西兰University of Otago的Peter C. Fineran课题组的大力支持和帮助。

 

原文链接：https://advances.sciencemag.org/content/6/31/eabb6651

 

关于此报告的任何问题，请联系蔡奕明博士([email protected]), 谢谢。

1. World Health Organization (2019) Global tuberculosisreport – 2019.

2. J. P. Norton, M. A. Mulvey, Toxin-antitoxin systemsare important for niche-specific colonization and stress resistance ofuropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 8, e1002954 (2012).

3.S. Helaine, A. M. Cheverton, K. G. Watson, L. M. Faure, S. A. Matthews, D. W.Holden, Internalization of Salmonella by macrophages induces formation ofnonreplicating persisters. Science 343, 204–208 (2014).

4.R. Page, W. Peti, Toxin-antitoxin systems in bacterial growth arrest andpersistence. Nat. Chem. Biol. 12, 208–214 (2016).

5.P. C. Fineran, T. R. Blower, I. J. Foulds, D. P. Humphreys, K. S. Lilley, G. P.Salmond, The phage abortive infection system, ToxIN, functions as a protein-RNAtoxin-antitoxin pair. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 894–899 (2009).

6.D. C. Pecota, T. K. Wood, Exclusion of T4 phage by the hok/sok killer locusfrom plasmid R1. J. Bacteriol. 178, 2044–2050 (1996).