2019年国家自然科学基金竞争十分激烈，全国共有1400多家单位申报的项目获得立项，立项总数为41752项。总资助金额超过210亿元。其中，医学科学部共批资助10138项（不含杰出青年基金项目），批准资助金额共计44.13亿元，单项平均资助金额43.53万元。大热门赢家是m6A和非编码RNA，RNA甲基化特别是m6A方向的增长简直是激动人心！至少140项资助项目涉及此热点，而2018年只有67项，整整翻了一倍！对于2021年的基金申请，吉康医学依然看好m6A热点。
N6-腺苷酸甲基化修饰（m6A）的概述
说起RNA甲基化，已知RNA存在超过100种修饰。在真核生物中，5’端的Cap以及3’的ployA修饰在转录调控中起到了十分重要的作用，而mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。mRNA最常见的内部修饰包括N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羟基化（m5C）等。
早在20世纪70年代，研究者就发现了N6-甲基腺苷（m6A）修饰，m6A是能够发生在mRNA、长链非编码RNA（lncRNA）等RNA腺嘌呤（A）上的甲基化修饰。在目前已知的171种RNA转录后修饰中，m6A是大多数真核生物mRNA和lncRNA中最丰富的修饰之一，占哺乳动物RNA中腺苷酸的0.1%-0.4%和核糖核苷酸总甲基化的50%。除了在植物和脊椎动物中存在着广泛的m6A修饰外，在单细胞生物如细菌、酵母等RNA中也发现了这种修饰。m6A修饰主要发生在RRACH（R = G或A，H = A，C或U）共有序列中，通过高通量测序发现，m6A并不是随意分布，而是在终止密码子、3′ 非翻译区（3′ UTR）、以及内部长外显子区域聚集，并且在前体mRNA中发现的更多。类似于DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传修饰，m6A甲基化参与细胞活动中重要功能基因精细而复杂的生物学调控。越来越多的研究表明，m6A修饰参与了人类复杂疾病的发生过程，尤其在癌症的发生发展中扮演着重要的角色。
m6A修饰的影响因子
m6A这种甲基化修饰被证明是可逆化的，包括甲基化转移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和甲基化阅读蛋白（Readers）等共同参与了修饰过程。其中甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用就是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。甲基化阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。
1、m6A甲基化转移酶（Writers）
甲基化转移酶（methyltransferase）也叫Writers，是一类重要的催化酶，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白并不是各自孤立的，而是会形成复合物（complex）共同行使催化功能。由于酵母和线虫等生物缺少这四种核心蛋白中的一种或几种，所以m6A甲基化修饰属于高等真核生物独有的碱基修饰反应。
2、m6A去甲基化酶（Erasers）
在真核生物中，已发现的m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein，属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关，FTO被敲除或过表达都会显著改变小鼠的体重。ALKBH5是另一种重要的去甲基化酶，能够对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰，在N端有丙氨酸富集区和独有的卷曲螺旋结构（coiled-coil structure）。在细胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修饰水平显著上升。
3、m6A甲基化阅读蛋白（Readers）
RNA pull-down实验已经鉴定了多种阅读蛋白，包括YTH结构域的蛋白、核不均一核糖蛋白（hnRNP）以及真核起始因子（eIF）等。YTHDF1-3主要在胞浆中特异性识别m6A修饰的mRNA，而YTHDC1-2的作用部位主要在细胞核内。eIF3蛋白能够与RNA 5’端UTR上发生m6A修饰的碱基相结合，从而促进mRNA的翻译。
m6A修饰的功能
1、影响mRNA前体的剪接
mRNA前体的剪接是基因表达中的重要步骤，它涉及内含子的精确切除和初级转录本外显子的连接以产生成熟的mRNA。最早提出的m6A的作用，是作为RNA剪接的调节剂。目前已有许多证据支持m6A与RNA剪接的相关性，但确切的机制尚不清楚。例如，从METTL3敲低的HepG2细胞的m6A-IP/RNA-seq数据分析显示，许多基因特别是甲基化基因显示异构体水平的差异表达，但是基因水平并无差异。同时，剪接的外显子和内含子富集m6A峰，表明m6A与mRNA的选择性剪接之间的内在联系。m6A对RNA剪接的作用可能是由于甲基化的发生会干扰剪接因子和mRNA之间的相互作用，m6A簇可能作为某些RNA结合蛋白的对接位点；或者，由于m6A使A-U碱基配的稳定性降低，RNA二级结构受到影响。
2、调控RNA的核输出
RNA剪接后，成熟的mRNA必须从细胞核中输出以在细胞质中翻译或降解。研究者检测到STH处理的HeLa细胞中细胞核mRNA的保留时间增加了40％，但是多聚腺苷酸化的RNA没有变化。在具有增强m6A水平的ALKBH5缺陷型细胞中，通过5-溴尿苷（BrU）掺入分析观察到新生合成的RNA主要分布在细胞质中。据报道，不同的RNA种类通过核孔复合物利用不同的途径进行核输出。TAP-P15复合体是在衔接蛋白如ALY/REF衔接子、SR蛋白和TREX复合物的协助下用于mRNA输出。由于ASF/SF2的磷酸化水平决定其在剪接或核输出中的功能，因此推测由ALKBH5缺陷引起的ASF/SF2磷酸化减少将加强其与TAP/P15复合物的相互作用从而导致核mRNA输出加速。与mRNA不同，rRNA可以招募几种不同的途径使其出口更有效率。rRNA核出口可能不会受到ALKBH5缺陷的显着影响。
3、调控mRNA翻译
大多数m6A修饰发生在外显子，在剪接后m6A仍保留在成熟的mRNA中。因此，m6A也可以影响含该修饰mRNA的翻译。小鼠DHFR mRNA体外甲基化后用兔网织红细胞系进行体外翻译，在比较甲基化转录物的翻译水平和非甲基化转录物的翻译水平时，检测到甲基化mRNA的翻译水平增加1.5倍。当从环亮氨酸处理的细胞中纯化的细胞质转录物在体外翻译时，由甲基化mRNA产生的DHFR蛋白的量比未处理的mRNA低20％。近期，使用体外翻译以及将报告基因mRNA转染入细胞的研究显示，与未甲基化的转录物相比，腺苷甲基化导致翻译减少。因此，m6A对蛋白质生产的影响似乎在不同的mRNA中是不一致的。
4、影响mRNA的稳定性
mRNA降解的调节是影响总体细胞mRNA丰度的主要因素。由于在poly（A）尾部中未检测到m6A，因此它可能不涉及聚腺苷酸化依赖性的mRNA降解。Camper SA等人已经通过用STH处理HeLa细胞来检查对mRNA稳定性的影响发现，尽管在高达500μM STH的处理下m6A几乎被完全抑制，但mRNA稳定性没有受到很大的影响。然而，通过高通量测序分析，m6A也富集在3’UTR区域中，3’UTR包含mRNA降解所需的几个重要功能域，如富含AU的元件（ARE），铁反应元件（IRE）和细胞质聚腺苷酸化元件（CPE）。同时，3’UTR是microRNA（miRNA）靶向的区域，因此不能排除m6A参与调控mRNA稳定性的可能性。
5、与microRNA的关联性
MeRIP-Seq数据集的分析揭示了m6A与miRNA结合位点之间的存在着很强的相关性。67％的含有m6A峰的3’UTR也含有至少一个由TargetScan预测的miRNA结合位点。有趣的是，m6A峰和microRNA位点不重叠。通常，m6A峰在终止密码子附近是最丰富的，并且通常沿3’UTR长度推进而水平降低。而microRNA靶位点在3’UTR的末端富集。m6A在3’UTR和miRNA结合位点的存在暗示了mRNA甲基化和microRNA之间的相互作用。确定腺苷甲基化是否有助于microRNA诱导的mRNA沉默作用对于将来的研究是非常重要的。
m6A甲基化检测方法
目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC-MS）等。高通量测序偏向单碱基水平鉴定m6A；而比色法与LC-MS/MS比较相似，也是从整体水平上检测RNA上m6A甲基化水平。
MeRIP–Seq（m6A RNA immunoprecipitation，或m6A-Seq）：首先通过m6A特异性的抗体进行免疫沉淀富集，然后通过高通量测序的方法进行分析，以检测发生m6A修饰的RNA转录本。该方法可将m6A残基定位在100–200 nt的转录本区域中，无法在全转录组水平上鉴定m6A的精确位置。
miCLIP（m6A individual-nucleotide-resolution Cross-Linking and ImmunoPrecipitation）：含有m6A的RNA与相应抗体结合以后，通过紫外进行交联，反转录得到的cDNA会出现突变或者截断，这样就可以指示m6A的存在。该方法的分辨率为单核苷酸水平。
选择RNA甲基化作为方向设计课题，可以从哪些方面着手？
总体来看，以RNA甲基化修饰为主题的基金申请还是一个蓝海， 因此如果想选RNA甲基化修饰作为研究方向设计课题，可以从以下四种思路着手：1、研究RNA甲基化修饰过程中的参与者（Writer、Eraser和Reader）分子在疾病或者某一生命过程中的功能。比如：Mettl3介导m6A甲基化修饰调控慢性炎性疼痛机制研究。2、通过MeRIP–Seq/miCLIP等方法首先揭示疾病或者某一生命过程中RNA甲基化修饰的变化，即揭示疾病特异性m6A RNA甲基化图谱。3、揭示疾病或者某一生命过程中某一基因的特定RNA甲基化修饰与疾病的关系。例如，RNA甲基化修饰、基因转录后调控（比如选择性剪接或者翻译，再或者microRNA的产生过程）、基因表达异常、再到疾病或者某一生命过程。4、鉴定参与RNA甲基化修饰的新分子，或者建立研究RNA甲基化修饰的新方法。以上四种思路的研究难度是逐渐增加的，大家如果想选RNA甲基化修饰来作为研究方向，可以考虑逐渐增加难度，其中第4条建立新方法或者鉴定新分子可以说是科学家的工作了。
小编结语
在过去几年中，由于高特异性抗体的可用性和高通量测序技术的可及性，使得鉴定m6A RNA甲基化的化学基础和多种功能成为可能。尤其是m6A IP（交联和免疫沉淀）和RNA-seq技术的快速发展，已证实m6A参与了多种恶性肿瘤的发生发展。这将使与m6A相关酶或m6A依赖途径的靶向成为可能，从而为m6A靶向治疗人类癌症提供重要科学依据。然而，尽管m6A在癌症中的作用已逐渐揭示，但仍存在许多挑战。首先，某些肿瘤中m6A调节因子的机制在很大程度上是未知的，比如虽然很多研究显示，m6A相关调节因子和作用途径可作为癌症治疗中的新的靶点，但缺乏一定的临床实践；其次，m6A甲基化修饰的“Readers”在癌症中的作用和机制仍然是个未知。尽管m6A在许多方面都能影响基因的表达，其副作用也不可忽视。未来的工作旨在深入研究m6A修饰中的“Writers”、“Erasers”和“Readers”参与疾病进程调节的分子机制，结合临床数据评估m6A与疾病的相关性，进一步增强研究者对于肿瘤恶性转化的理解，并助力于设计新的治疗癌症药物。
