实验教程:凋亡细胞的单细胞电泳检测

• DNA链断裂：细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
• 在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
• DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越小，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
• 该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。

• 材料：HeLa细胞（或别的细胞），毛玻璃片 盖玻片、计数板、微量移液器吸头。
• 试剂：凋亡诱导剂（根据情况自定），磷酸缓冲液（PBS）、消化液（O.02%ED-

  TA）、中和液、低熔点胶、常温熔点胶、EB（2μg/ml）。

• 设备：计数板、相差倒置显微镜、超净台（实验前紫外照射30min）、离心机、CO2孵箱、荧光显微镜、微量移液器、水浴箱、微波炉、电泳仪、电泳槽、紫外灯。

03  试剂配制

• 碱性裂解液：2.5mol/L NaCl；100mmol/L EDTA-Na2↓10mmol/L Tris；1%肌氨酸钠；临用前加10%DNMSO和1%Triton X-100。
• 电泳缓冲液：1mmol/L EDTA-Na2；300mmol/L NaOH；Tris-HCl（pH 7.5）。
• 熔点胶：用PBS配制0.5%常温熔点胶、0.5%低熔点胶和1%低熔点胶。
• 中和液：0.4mol/L Tris-HCI（pH 7.5）。

04  实验步骤

• 样品处理：培养细胞，诱导凋亡，然后消化细胞，用PBS洗2次，并制成单细胞悬液，细胞浓度为2X10⁵个/ml。
• 制备第一层胶：取200ml 0.5%常温熔点胶（45C左右），加盖盖玻片，4C固化10min.
• 制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，取50μl 1%低熔点胶（37C）和50μl细胞悬液混匀后滴加在第一层胶上，加盖盖玻片，4C固化10min.
• 制备第三层胶：小心去除盖玻片；取75μl 0.5%低熔点胶（37C）滴加在第二层胶上，加盖盖玻片，4C固化10min。
• 裂解：裂解去掉盖玻片，将凝胶浸人预冷的碱性裂解液内（临用前加10%DMAO，1%Triton X-100），4C裂解1h。
• 漂洗：取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加人碱性的电泳缓冲液（pH 10），没过玻片约2~3mm，放置20min.
• 电泳：以电压25V，电流300mA，电泳20min。
• 漂洗：取出玻片，用PBS（pH 7.5）漂洗后，置于中和液2次，每次15min.
• 染色：染色胶上滴加50μl EB，加盖盖玻片，染色10min.
• 阅片：荧光显微镜下观察并拍照片。

• 毛玻璃片：毛面要粗糙，否则易脱胶。
• 制胶过程：每次自胶面移除盖玻片时，均需小心。
• EB:EB为强诱变剂，有中度毒性。操作时应藏手套。EB污染物及废弃液应单独存放。