实验教程|石蜡切片技术

• 仪器与材料：恒温干燥箱、石蜡切片机，展片盒、烤片机、拨针、标本瓶、标签纸、滤纸、镊子、刀片、量筒、漏斗、滴管、酒精灯、切片刀、小木块（或蜡块托）、蜡铲、载玻片、毛笔、切片盒、切片架、蜡杯、浸蜡盒、包埋盒。
• 材料和试剂：固定液、70%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、切片石蜡、蛋白甘油。

03  试剂配制

• 固定液：多采用10%甲醛水溶液。取10ml甲醛再加入蒸馏水90ml。
• 70%乙醇：取95%乙醇70ml再加入蒸馏水25ml。
• 85%乙醇：取95%乙醇70ml再加入蒸馏水10ml。
• 95%乙醇（原装）。
• 无水乙醇（原装）。
• 二甲苯（原装）。
• 切片石蜡（熔点为54~62℃）。
• 蛋白甘油：取鸡蛋的蛋白加入等量的甘油搅拌混合，至均匀为止。加入约为1%量的麝香草酚（一小粒），借以防止微生物的侵入和腐败。置冰箱备用。

04  实验步骤

• 取材与固定：根据不同的实验目的，选择相应的组织材料，及时投入盛有固定液体的标本瓶中，组织要求新鲜，避免挤压，挫伤和干枯。固定液的用量一般为材料的10~15倍或稍多，常规固定时间为12~48h（根据组织块大小而定）。
• 打开恒温干燥箱调至62℃（熔蜡）

  ①放入两个盛有适当熔点石蜡的蜡盒使蜡熔化，组编为（I）号、（II）号。

  ②放入盛有适当熔点石蜡的蜡杯使蜡熔化（包埋备用蜡）。

• 脱水与透明步骤

  ①倒出固定液。

  ②70%乙醇，1~2h（根据组织块大小而定）。如不及时使用，可放入冰箱4℃保存。如间隔时间较长，可在乙醇中加入适量甘油，再放入冰箱中保存。

  ③85%乙醇1~2h（根据组织块大小而定）。

  ④95%乙醇，为保持浓度稳定，中间更换一次同等液体，两次共1~2h（根据组织块大小而定）。

  ⑤100%乙醇，为保持浓度稳定，中间更换一次同等液体，两次共1~2h（根据组织块大小而定）。

  ⑥二甲苯，为保持浓度稳定，中间更换一次同等液体，两次共40min~2h（根据组织块大小而定）。

• 浸蜡透明的组织：从二甲苯中取出，立即放入（I）号蜡盒，0.5h后放入（II）号蜡盒，一股为1~1.5h（根据组织块大小而定）。
• 包埋：将熔化蜡倒人包埋盒，用温镊子夹取组织块放入盒的中央位置，待石蜡全部凝结变硬即可取出。
• 修切蜡块：把包埋好的蜡块用刀片修切成正方形或长方形，注意勿太靠近组织，让组织四周留有少许石蜡，蜡块两边必须切成平行的直线，以免切下的蜡条弯曲。
• 固定蜡块：取小木块，用蜡铲在酒精灯上加热，使石蜡块底面熔化一层粘于小木块上，冷却后装在切片机上。
• 载玻片：取干净的载玻片涂以甘油蛋白：以玻璃棒尖端稍取甘油蛋白一滴，轻轻滴于载玻片中央，常以洗净的手指加以涂布，涂布的面不宜太广，而以恰恰能够贴附蜡片为度。甘油蛋白不能涂布过多，否则，会形成白膜，妨碍观察。
• 切片：在开始切片前，先熟悉切片机的构造和用法，装上切片刀，注意刀的倾角不宜过大，亦不宜过小，大致，上以20~30C为宜。如倾角过大，则切片上卷，过小，则切片皱起。
• 切片时应做到下列各点：

  a.调整刻度指针到要求的厚度，一般要求5~8μm，切片刀要拭净；

  b.用右手摇切片机转轮，左手持毛笔托住蜡带，转动切片机时不可太快，用力宜均匀，不可时快时慢，防止机器振动太厉害，以致切片厚薄不均匀；

  c.用毛笔托住蜡带，放在展片盒内（水温宜在48°C左右）展片。

• 贴片：蜡带受热即自动展开，也可用拨针轻轻拉开。待蜡片完全展平后，用滤纸吸去多余水分。注意切片和载玻片之间不能有气泡，否则在展片时气泡会扩大，甚至致使切片破损、变形，影响组织观察。
• 烤片：将贴片置人37~62*C恒温干燥箱干燥12h。干燥后片子常温、阴凉处保存待实验时用。

• 在85%乙醇内组织可保留较久，如果当天来不及做完，可暂保存一晚，第二日再做。
• 组织放入二甲苯后，待组织块透明后，立即浸蜡，外曝露时间过长组织易干。
• 浸蜡以前，先做好准备工作，恒温干燥箱中分装在（I）号、（I）号蜡盒的石蜡应已完全熔化，保持恒定。
• 蜡片出现裂隙或碎裂可能与组织浸蜡不足，或浸蜡温度过高，或在透明剂中时间过久有关，组织易发脆。
• 蜡片厚薄不一可能与刀或蜡块未固定牢，切片机磨损发生故障有关。
• 蜡片卷起可能与刀口太钝或不清洁，刀的角度过大或石蜡过硬有关，试用手温或温水在蜡块，上轻涂布一下。
• 蜡片易粘在切片刀上或蜡片皱缩可能与室温过高、刀的角度过小或石蜡太软有关，试用冰块冰一-下即可。
• 蜡带弯曲可能与蜡块上下不平行，刀钝，蜡块不与刀刃平行有关。