实验教程:凋亡细胞的电镜观察

• 凋亡细胞的变化特点：凋亡细胞除染色质发生变化外，其亚细胞结构也出现相应的变化，如核破裂，形成电子密度增强的膜包体；细胞膜芽生出泡，凋亡小体形成等。这些变化在分辨率较高的电子显微镜下能很好显示。
• 电子显微镜：电子显微镜使用电子束来对样品成像，将分辨率自光镜的0.2um提高到约0.2nm，可为细胞死亡类型提供最确切的证据。电子束与样品中的原子相互作用可产生弹性散射和非弹性散射，弹性散射和非弹性散射联合作用产生了最终的图像。用铅、铀和锇等重金属对生物样品的特定区域进行染色，可以增加该区域的弹性散射，加强图像的对比度。此外，透射电子显微镜样品的固定、脱水及切片厚度均与光镜不同。

• 材料：已诱导凋亡的细胞，染缸、10ml的锥形离心管、500ml锥形瓶、塑料棒蕊、胶囊、10ml吸管、吸管橡皮球。
• 试剂：消化液（0.02%EDTA）、PBS、蒸馏水、琼脂糖、乙醇-树脂（1：1）、树脂、醋酸铀-柠檬酸铅、4%多聚甲醛/0.1mol/L磷酸缓冲液、1%锇酸（二甲胂酸钠缓冲液配制）、梯度乙醇。
• 设备：微波炉、离心机、恒温烤箱、超薄切片机、透射电镜。

03  试剂配制

• 0.2mol/L磷酸缓冲液（储备液）：甲液：磷酸氢二钠Na2HPO4·2H2O35.61g加蒸馏水至1000ml；乙液：磷酸二氢钠Na2 HPO4·2H2O 27.60g加蒸馏水至1000ml。
• 工作液（pH7.2）：甲液（36.0ml）+乙液（14.0ml）总50ml。
• 工作液（pH7.4）：甲液（40.5ml）+乙液（9.5ml）总50ml。

• 制备琼脂离心管：用蒸馏水将琼脂配成20g/L溶液，加热溶解。灌入一10ml的锥形离心管，其中央竖放一下端尖细的棒蕊，凝固后抽出棒蕊，备用。
• 收集细胞：将消化的贴壁细胞放入离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，用冷PBS（4℃）洗，5mlPBS悬浮细胞并将其加入琼脂离心管。2000r/min离心15min，弃上清液。
• 固定：加入适量的4%多聚甲醛固定15min后取出离心管中的琼脂块，用刀修出含细胞团的琼脂块（可放入含4%多聚甲醛的小瓶，在4℃下长期保存）。
• 洗涤：PBS（4℃）洗3×5min。
• 固定：1%锇酸（4℃）固定30min。
• 洗涤：蒸馏水（4℃）洗3×5min。
• 脱水：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇（I）和100%乙醇（Ⅱ）各2min。
• 浸透：1：1的乙醇：树脂60min，100%的树脂2×60min。
• 包埋：将胶囊放置60℃恒温烤箱2h，将包埋剂灌入胶囊并放置标签；将细胞团的琼脂块移至胶囊的中央，静置，使其自然沉降至胶囊的底部后，置于60℃恒温烤箱48h。
• 切片。
• 染色：醋酸铀-柠檬酸铅染色。
• 电镜：TEM下观察。