瓜瓜师姐今天给大家更新凋亡细胞的荧光显微镜观察实验教程~
为了方便大家阅读，先奉上目录思维导图：
（一）Hoechst33258染色法
01 原理与应用
- 凋亡状态：细胞凋亡时，其核染色质的DNA出现缺口甚至断裂，致使染色质凝聚、边缘化甚至呈现DNA碎片。
- 利用与DNA结合的荧光染料染色后，在荧光显微镜下即可观察到上述变化。
- Hoechst33258为与A-T结合的特异性DNA染料，对活细胞和固定细胞均能染色。
02 仪器与设备
- 材料：HeLa细胞（或别的细胞），载玻片、盖玻片、计数板、10ml吸管、吸管橡皮球、10ml离心管、微量移液器吸头、滴管、滴管橡皮头。
- 试剂：凋亡诱导剂（根据情况自定）、固定液（4%甲醛，或多聚甲醛）、磷酸缓冲液（PBS）、消化液（0.02%EDTA）、Hoechst33258染液。
- 设备：计数板、相差倒置显微镜、超净台（实验前紫外照射30min）、离心机、37℃ CO2孵箱、荧光显微镜、微量移液器。
03 试剂配制
- Hoechst33258染液：Hoechst332581mg；加入蒸馏水1ml。
04 实验方案
- 诱导凋亡：培养细胞，诱导凋亡（在超净台进行）。
- 收集细胞：收集细胞先用滴管轻轻吹打，收集已脱落的细胞至离心管。加入适量的0.02%EDTA（3~4ml）消化未脱壁细胞并收集至上述离心管。1000g离心5min，弃上清液（悬浮细胞直接收集）。
- 漂洗：PBS（37℃）漂洗悬浮细胞。
- 固定：固定液（4℃）固定5min，500~1000g离心5min，弃上清液。
- 水洗：蒸馏水洗，500~1000g离心5min，弃上清液。
- 调整细胞数：调整细胞数至（0.5~2.0）×105个/ml。
- 加染液：取100ul细胞悬液，加入1ul Hoechst33258染液，10min。
- 涂载玻片：将10ul染色的悬浮细胞涂于载玻片，加盖玻片。
- 荧光观察：荧光显微镜下观察。选用UV激发滤片和400~500nm阻断滤片。
05 注意事项
- Hoechst33258染液应4℃避光保存。提示学生小心甲醛。
06 实验结果及分析
- Hoechst33258染色：细胞核呈蓝色。凋亡细胞的核染色质凝聚且边缘化，或玻珠化，并可呈现DNA荧光碎片。
（二）吖啶橙-溴化乙锭（AO-EB）染色方法
01 原理与应用
- 吖啶橙染色：吖啶橙（acridine orange，AO）能同时与DNA和RNA结合，对活细胞和死细胞均能染色。
- 溴化乙锭染色：溴化乙锭（ethidium bromise，EB）插入双链核酸，对失去膜完整性的细胞染色。
02 仪器与设备
- 材料：HeLa细胞（或别的细胞）、载玻片、盖玻片、计数板、10ml吸管、吸管、橡皮球、10ml离心管、微量移液器吸头、滴管、滴管橡皮头。
- 试剂：凋亡诱导剂（根据情况自定）、固定液（4%甲醛，或多聚甲醛）、磷酸缓冲液（PBS）、消化液（0.02%EDTA）、AO染液、EB染液。
- 设备：计数板、相差倒置显微镜、超净台（实验前紫外照射30min）、离心机、37℃CO2孵箱、荧光显微镜、微量移液器。
03 试剂配制
- AO染液：吖啶橙100μg加入PBS 1ml。
- EB染液：溴化乙锭100μg加入PBS ml。
04 实验方案
- 诱导凋亡：培养细胞，诱导凋亡（在超净台进行）。
- 收集与离心：收集细胞先用滴管轻轻吹打，收集已脱落的细胞至离心管。加入适量的0.02%EDTA（3~4ml）消化未脱壁细胞并收集至上述离心管。1000g离心5min，弃上清液（悬浮细胞直接收集）。
- 漂洗：PBS（37℃）漂洗悬浮细胞。
- 固定：固定液（4℃）固定5min，500~1000g离心5min，弃上清液。
- 水洗:蒸馏水洗，500~1000g离心5min，弃上清液。
- 调细胞数：调整细胞数至（0.5~2.0）×106个/ml。
- 加染液：取25ul悬浮细胞滴于载玻片上，加入1μlAO-EB（1：1）染液，轻微混合。
- 封片：直接用盖玻片封片。
- 荧光观察：在装有荧光滤光片的荧光显微镜下观察。
05 注意事项
- EB为强诱变剂，有中度毒性。操作时应戴手套。EB污染物及废弃液应单独存放。小心甲醛。
06 实验结果及分析
- AO-EB染色：细胞呈均匀的绿色。
- 凋亡早期细胞的核中有鲜绿色的斑点。
- 晚期凋亡细胞核呈红色，核染色质凝聚并常常裂解。
结语
希望瓜瓜的分析能够对大家的实验有帮助~
日后还会分享更多实验技术，欢迎大家关注我哦！
