1. MTT的应用
MTT 法又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。但是它的缺点也很多，如果操作和数据处理方法不当，结果可信度和可重复性很低。
2. MTT的原理
MTT 全称为 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT 工作浓度为 5mg/ml。因此，可以称取 MTT 0.5 克，溶于 100 ml 的磷 酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用 0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放 -20℃ 避光保存即可。
3.实验步骤
1、铺板，使用96孔板，每孔细胞密度控制在4000-5000个，体积100 μl 每孔。
2、5%CO2，37℃孵育，正常4到6小时贴壁后即可,加入浓度梯度的药物。
3、5%CO2，37℃孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。
4、每孔加入 20 µl MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4h。若药物与 MTT反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。
5、终止培养，一次性像泼水一样，直接泼掉孔中的液体。
6、每孔加入 150 µl 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。
4. MTT实验系列—-注意事项（重点）
目前实验室MTT试验常用来评价某一种化合物或是材料对细胞的生存影响，用来拟合半数致死量、评价化合物对肿瘤的抑制率等等。
我们之前提过，MTT实验的主要缺点在于如果操作和数据处理方法不当，结果可信度和可重复性很低。因此这里我们着重，以拟合化合物IC50为例介绍操作中注意事项。
1）严格控制铺板密度和给药浓度（对结果影响最大）
96孔板孔径很小，如果细胞密度过大，药物对肿瘤的抑制作用作用越小。同时，收样前，对照组孔内如果已经长满细胞，就不能模拟出48小时后细胞的真实数量，对结果也有影响。
根据经验，建议铺板时每孔细胞个数在4000左右，给药时细胞密度控制在30%左右。孔底的细胞一定要均匀分布。
2）注意边缘效应
细胞培养过程中，边孔水分蒸发很快，因此边孔内药物浓度会浓缩，细胞状况会更复杂。因此铺板只用中间60孔，边缘36孔加入无菌PBS。
3）给药浓度
为拟合IC50，我们通常设置10个给药浓度，每种浓度5个复孔。收样时，最高浓度孔内细胞一定要抑制率能够达到90以上，并且同时有2个及以上点抑制率都能达到90%以上。
4）避光操作
MTT需要避光保存，加MTT时，如果使用排枪或是速度较快，可以暂时不用避光。但是如果需要长时间操作，一定要避光。
5）是否排枪操作
笔者之前一次性最多铺30多个96孔板，这种时候排枪就非常重要，可以节省很多时间，但是一定要注意，随时保持细胞混悬液中细胞均匀分布，才可以避免排枪铺板各孔细胞数相差太多。
5. 常用铺板方法
灰色为边缘孔，加入无菌PBS；绿色为空白组，不加细胞，只加入培养基和MTT。
黄色为对照组，加入细胞，不加药；蓝色为实验组，加入细胞和药物。
6. 实验数据处理
目前实验室MTT试验常用来评价某一种化合物或是材料对细胞的生存影响，用来拟合半数致死量、评价化合物对肿瘤的抑制率等等。
我们之前提过，MTT实验的主要缺点在于如果操作和数据处理方法不当，结果可信度和可重复性很低。因此这里我们着重，以拟合化合物IC50为例介绍数据处理中注意事项。
简单的计算过程：
抑制率=（实验组吸光度-空白组吸光度）/ (对照组吸光度-空白组吸光度)
以一次实验为例，我们的给药浓度从最高是50 μM，0.75倍逐渐稀释。这里有12个浓度梯度，再以Log 10为底计算浓度。
我们再看计算出来的抑制率，这里每个浓度只有四个复孔。
我们再用 GraphPad Prism 8.0 拟合,具体操作过程教程网上很详细。
输入数据
结果如下：
很显然拟合结果是78 μM是不可能的，从数据上来看，IC50应该在20 μM左右。那么问题出现在哪里？我们再看一眼拟合出的曲线。
曲线如下，很明显，曲线并不是标准的S形曲线，结合系列前两节，我们可以发现抑制率超过90%的点太少，抑制率低于10%的多大6个。因此造成了此次结果。
如果我们尝试增加两个浓度，在50以上增加两个浓度，并且且将这两个浓度的抑制率设置成50 μM一样。我们再看一次结果，此时拟合出的IC50更加真实可信，但是这次实验已经需要重复。
总结：MTT实验的操作过程，浓度设置，数据处理等过程一定要严谨规范，否则实验可重复性和可信度很低。
