▪ 应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使结合抗体的显色剂进行显色来确定组织或细胞内抗原，对其进行定位、定性及相对定量的研究。是生命科学研究中常用且重要的实验方法。
▪ 免疫组化的样本多使用石蜡切片，因为该种切片保存方便（常温），对组织形态有较好的保持，并且可以做抗原修复，缺点就是步骤繁琐。
▪ 先发一张我平时做IHC的protocol，每个实验室可能习惯不同，但大体的方法还是一样的，仅供参考。
样品的获取和切片制备
▪ 绝大多数IHC的样本都是活动物的组织，因此我们推荐采取心脏灌流的方式来获取组织样本。因为通过灌流可以把组织中大部分血液冲去，避免了后续染色过程中非特异性染色。灌流首先用生理盐水冲去血液，再替换固定液冲洗。注意事项：灌流过程轻柔缓慢，不要将液体灌进肺中，导致鼻孔或嘴里流出液体。灌流成功指标：肝脏颜色变浅，身体出现抽动。
▪ 获取组织后进行固定。固定液的选择：10%中性福尔马林或4%多聚甲醛溶液。固定液体积：组织体积的20倍。固定时间公式：t=(d/k)^2，（k对于一种固定剂来说是常数，10%中性福尔马林，k=0.78；d组织深度）。固定时间不足会导致假阴性实验结果，固定时间过长也会导致假阴性。固定温度：室温或4℃，提高温度可以提高固定剂的扩散速度，但是也会导致蛋白降解。
▪ 切片制备。尽可能在固定结束之后马上切，保持组织新鲜。因为我的样本都是送公司代切，自己并没有操作的经验。重要的是切片的方向位置，尤其是对于样本区域有高要求的，一定要事先查询相关组织的图谱进行考察。
▪ 脱蜡。关键是脱蜡是否充分，即二甲苯浸泡时间是否充足（注意通风橱操作哦，可回收）。脱蜡不足对IHC的影响：染色不均匀，阳性物时隐时现，背景增加，假阴性。脱蜡不足的因素：二甲苯处理时间和次数不足，二甲苯溶液陈旧，切片温度较低有水分。
▪ 至水。该过程中一定要保持切片处于水环境中，防止干片。干片会导致非特异性增加，出现假阴性。
▪ 目的：使固定过程中交联的抗原暴露，使抗体更容易与抗原结合。
▪ 修复方法：热修复：水浴加热，微波炉，高压锅；酶修复：胰蛋白酶，胃蛋白酶，蛋白酶K。影响修复的因素：大都数采用热修复，个人尝试过高压锅法和水浴法，高压锅较好。
▪ 修复液的选择。通常溶液pH值越高，修复能力越强，但是越容易脱片。柠檬酸盐 pH6.0，EDTA pH8.0，TE pH9.0。
阻断内源性过氧化物酶
▪ 目的：避免内源性过氧化物酶对后期DAB染色造成假阳性的结果。
▪ 配置双氧水的溶液有两种：PBS和甲醇。一般来说可以实现考察组织含有的过氧化物酶的多少，可以将切片与DAB染色液共孵育看是否显色。若显色较深，则含有较多的过氧化物酶，需要用甲醇溶液配置，否则使用PBS溶液配制，因为甲醇也会使得一些抗原隐藏。
▪ 注意避光
▪ 组织中内源性酶和抗体的封闭对于背景染色的最小化以及降低假阳性染色十分重要。这通常是通过用可封闭一抗或二抗也可能结合的非特异性位点的特定缓冲液对样品进行孵育而实现的。
▪ 很多操作手册推荐使用TBS作为稀释液，使得背景更干净。
▪ 可以先做个预实验，设置抗体浓度梯度进行浓度的筛选。设置一组不加一抗的对照组来考察背景值。
▪ 通常小鼠的组织加50ul体积，大鼠为100ul。
▪ 注意孵育过程中不要干片，可在孵育盒中加入湿纸巾。
▪ 一般使用HRP标记的二抗，注意孵育一抗后要清洗干净，否则会导致高背景。
▪ 染色时间需要提前筛选。可以从三分钟开始，每分钟将切片拿到镜下观察染色情况，从而确定染色时间。一般不超过10min。
▪ 苏木素等染色较为简单，参照试剂盒的protocol。
▪ 比较重要的是最后的封片。最好留有一点二甲苯在表面，不能完全挥干使得样本干片。
▪ 滴加中性树脂的量根据样本大小进行调整，盖盖玻片的时候不能留有气泡。可以将树脂液滴加在组织的一边，一边慢慢往另一边盖盖玻片。
总之，IHC想要获得满意的结果并不好做，影响因素较多，建议事先做预实验把条件摸清楚后再进行正式实验。
