PCR 问题及提高 PCR 扩增特异性的方法总结 （2）

扩增曲线问题

正常的扩增曲线一般呈 S 型，Ct 值最好在 20-30 之间。异常的扩增曲线包括曲线无平台期、曲线呈锯齿状和 Ct 值偏大等现象。

1. Ct 值偏大（如 Ct 值＞30）

1）模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察 Ct 值能否成相应倍数减少。

2）qPCR 整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。

3）扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或通过优化引物，扩增产物长度最好不超过 300bp。

4）体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

2. 扩增曲线无法达到平台期

基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。

3.扩增曲线平台期锯齿状

1）RNA 纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度 RNA 重新实验。

2）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

4.有熔解曲线，无扩增曲线

可能是扩增程序设置错误，未进行荧光信号搜集，建议重新实验，增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。

5. 阴性对照有扩增

1）NTC 有扩增，可能有以下两种情况：

①Ct＞35，熔解曲线 Tm 值＜80℃（一般正常 qPCR 产物，大小在 100-300bp 之间，熔解曲线 Tm大多在 80°C 以上），可能是引物二聚体导致，可进一步优化引物。

②有 Ct 值且＜35，表示反应体系被污染，可逐步排除污染源。

2）NRC 有扩增

NTC 正常，NRC 有 Ct 值，可能是 RNA 含有 gDNA 污染。建议用 DNase I 消化或使用含有 gDNA去除的反转录试剂盒。

【注】NTC 是指将 H2O 代替模板的阴性对照反应；NRC 是指将未反转录的 RNA 作为模板的阴性对照反应。

6.复孔重复性差

1）加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。

2）模板量低，建议提高模板量，使 Ct 值落在 15-30 之间。

3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

熔 解 曲 线 异 常

熔解曲线常用来判断 qPCR 结果的特异性，理想的熔解曲线为单峰，异常的熔解曲线会出现杂峰、

双峰、宽峰等可能的情况，下面我们来逐一分析。

1.熔解曲线出现双峰

1）双峰，较低峰 Tm 在 80℃之前

可能存在引物二聚体,建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。

2）双峰，双峰 Tm 在 80℃以后

①引物特异性过差导致非特异性产物扩增，建议 Blast 检查引物特异性或重新设计引物。

②gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。若 NRC 有 Ct 值，可重新制备模板。

2. 熔解曲线单峰但不尖锐

可能存在大小相近的非特异性产物，建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。

3. 熔解曲线单峰但 Tm 值在 80℃以前

推测是未加模板，仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复实验。

4.有扩增曲线，无熔解曲线

可能是熔解程序设置错误，未搜集荧光信号，建议重新实验，增加熔解曲线阶段的信号搜集。

5.熔解曲线峰型杂乱

1）反应体系污染，结合 NTC 和 NRC 结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。

2）试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。

3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

4）耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。

6.两种试剂对比，得到的 Tm 值不一样

可能是试剂的促解链成分或含量不一样，导致解链温度不一样。