PCR 问题及提高 PCR 扩增特异性的方法总结（1） 基础实验 20年8月14日 转载大师 取消关注 关注 私信 1. PCR 常见问题分析 问题 1：假阴性（无扩增产物） 现象：正对照有条带，样品无条带 可能原因： • 模板：含有 Taq 酶抑制剂、杂蛋白，模板上样量低或模板降解 • 引物：引物降解，引物设计不合理 • 试剂：酶失活，buffer 不合适 • 反应条件：退火温度高，延伸时间短 解决方法： • 纯化模板并重新提取，并检测模板是否含有抑制剂 • 重新设计引物并低温保存 • 优化 buffer，摸索镁离子浓度或适当加入 DMSO（小于 0.3%） • 提高退火温度，增加延伸时间（反应条件参照试剂盒说明书） 问题 2：假阳性 现象：空白对照出现条带 可能原因： • 引物设计不适，与目的序列具有同源性 • 试剂污染：水、移液枪等被核酸污染 • 样品间出现交叉污染 解决方法： • 实验仪器高压灭菌 • 实验试剂（酶除外）高压灭菌，离心管枪头一次性使用 • 规范实验操作 • 假阳性可通过巢式 PCR 解决，或者使用特异性较高的试剂盒扩增 问题 3：拖尾、弥散 现象：电泳出现拖尾、涂抹带 可能原因： • 酶用量过多 • 模板纯度较低 • dNTP、镁离子浓度过高 • 循环次数过多 解决方法： • 减少用酶量或使用特异性高的热启动酶扩增 • 纯化模板 • 减少 dNTP 用量，摸索镁离子浓度 • 减少循环次数 问题 4：二聚体及非特异性产物 一般小于 100bp 的条带可基本判断为引物二聚体 主要原因：13 • 引物设计不合理，引物自身具有互补性 • 引物浓度不适 • 镁离子浓度过高，退火温度过低 解决方法： • 重新设计引物并进行 BLAST 检测 • 降低镁离子浓度，提高退火温度 • 增加模板用量 2. 提高 PCR 反应特异性的方法 1. 引物的设计 引物最好在模板 cDNA 的保守区设计，长度 15-30bp，GC 含量小于 60%，3’端不超过连续三个G或C，碱基分布错落有致，避免引物自身形成二聚体，设计完成之后，需进行 BLAST 检测，如果与其他基因不具有互补性，则可以进行下一步实验。 2. 降落 PCR 降落 PCR 是一种简单的降低非特异性产物的 PCR，最大的优点就是可以降低实验耗时，同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度，退火温度过高会使 PCR 效率过低，过低则会使非特异扩增过多。 这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落 PCR 提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高 PCR 的特异性和效率。 3. 热启动扩增 采用热启动方法进行扩增，是除了设计最佳引物之外，提高 PCR 反应特异性最好的方式。在一般的PCR反应中，试剂的配置需在冰上进行，且要将 PCR 仪预热，这种方法就类似于热启动，能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性，只要体系中有 DNA 链存在，就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之前完全抑制酶的活性，而最有效的方法就是使用热启动 Taq 酶（或热启动高保真聚合酶）去扩增，它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心，当温度上升到 95℃时恢复活性，指导扩增。 4. 巢式 PCR 采用巢式 PCR 进行扩增，在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通 PCR 不同的是，它采用两对引物进行扩增，首先用第一对引物普通 PCR，然后将第一轮扩增的产物稀释 100 倍后用第二对引物（巢式引物）二次扩增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。 合适的琼脂糖凝胶的浓度 琼脂糖凝胶浓度与 DNA 分离范围 琼脂糖凝胶浓度 DNA 分离范围 0.3% 5000-60000 0.5% 1000-30000 0.7% 800-12000 1.0% 500-10000 1.2% 400-7000 1.5% 200-3000
