伯乐Turbo快速半干转SOP及使用技巧

导语

品牌机型:美国BIO-RAD,
实验经验:2014.5-至今,

实验时间:常用7min,10min,经优化也可以3min。

使用心得:当年本小白初来乍到玩的第一个仪器,开始也是一头雾水,眼睁睁看着自己配的常规配方凝胶因为高产热毁掉。根据厂家提供说明书摸索过多种转印缓冲液配方测试效果,体会就是细节决定成败。
仪器介绍:2抽屉设计,分为A槽和B槽(仪器有标记),每槽同时可装1-2块mini protein gel。按键操作,同时仅设置1种程序。主机自带电源,使用时打开开关,30s内自检后可以进行使用。经典转印时间7-10min。商品化kit可以做到3min。

外观

抽屉及三明治结构如图:你只需要记住负极挨着带负电的SDS凝胶,正极挨着带正电的各种膜,上下夹住厚滤纸,所有的核酸、蛋白质转印三明治夹法均一致。

操作流程

01.垂直电泳后,将胶、泡好的pvdf膜、滤纸,放入4℃预先冷却的1*转膜液平衡10min。
02.按照上图顺序铺三明治结构放入转膜槽中,注意保持仪器干燥。
03.锁住转膜槽插入仪器中,开机自检。后进入这个界面。

04.用导航键点选LIST,进入BIO-RAD内置程序。根据需要选择相应程序。也可以任意选择程序后edit运行程序细节。
05.选好后,点RUN。进入程序运行界面,选择插入槽的位置点A RUN或B RUN,开始运行。如中途加入另一转膜槽,则继续点击RUN可以进入上一转膜槽同一程序开始运行。

我的操作心得

01

缓冲液的选择:

①商品化专用5*缓冲液:选用这个注意瓶身有标记使用时如何配比。

1瓶1L,稀释后5L,每个三明治充盈液体大约吸收75ml左右。但进行平衡时尽量多配一些体积,保证浸泡完全均匀,我自己会配500ml,用完后回收。平衡的目的是为了离子强度一致,效果更好。250kD蛋白-10kD蛋白毫无压力。

②自己配缓冲液,我尝试过湿转配方,半干转配方,加乙醇,不加乙醇,加甲醇不加甲醇,各种比例几个配方,个人感觉半干转配方,在自配配方中更好些,但操作稳定性不及商品化转印液(商品化配方更利于新手上手或出于时间成本考量)。具体如下: 

 Tris 
5.82g 
glycine
2.93g
SDS
0.375g(或10%SDS 3.75ml
甲醇
200ml
以上ddh2o定容至1000ml

③心得体会:如果有条件尽量买商品化的配方,使用操作时重复性及效果都会比较好。如果是尝试自配配方,尽量多平衡,需要时间上手,反复练习更容易提升重复性。经验是至少200kD-10kD蛋白,若老手操作,可以保证各种转印效果重复性(成功率)90%左右。

02

膜的选择:

不同品牌基本都有印记膜在售。种类上有NC膜,PVDF膜,低荧光背景PVDF膜可选。孔径上有0.45um孔径和0.2um孔径可选;大孔径做大蛋白转印,小孔径做全蛋白(大+小)转印。手感厚的PVDF可以适当增加甲醇活化时间。

03

推荐程序:

①商品化专用5*转膜缓冲液,搭配厂家TGX/TGX stainfree预混液配制凝胶,推荐恒压25V,2.5A,7-10MIN;基础上可摸索。
②自己配缓冲液,搭配普通配方自配胶或者商品化预混液自配胶,我常用的条件是,1胶时恒流1.3A,限压25V,13min;2胶时恒流2.5A,限压25V,13min。基础上可摸索。

③在国内,如果购买商品化产品,建议购买预混合液自己配制凝胶,这样比直接购买伯乐预制胶成本节省约十倍。商品化产品,实验结果更有保障,如全自配,也需要在上述条件基础上进一步优化。

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