RIN (RNA integrity number)是判定RNA完整性的重要指标。在做RNA-Seq测序前,用Agilent 2100生物分析仪系统来检测即将用于测序的RNA样品的完整性,反映完整性的指标即为RIN值,RIN值最高为10,代表RNA的完整性非常好,最低值为0,代表RNA的完整性很差。
对于基因测序检测平台,会对用于做RNA-Seq样品的RIN值有要求,比如Illumina测序平台建议RIN值要≥8,各家基因测序公司对RIN的要求会略有不同,但一般集中在要求大于6-大于8之间。那么,有没有文献证实RIN值多少能满足RNA-Seq的需要呢?
美国芝加哥大学科学家Irene Gallego Romero等人曾发表文章,用不同RIN值的RNA样本来做测序,探讨不同RIN值的样本对测序数据的影响。
作者从4个个体的32份PBMC样本中提取RNA。在提取RNA之前,PBMC样品在室温下保存0、12、24、36、48、60、72和84小时。如预期的那样,提取的时间显著影响RNA质量0小时mean RIN=9.3,84小时meanRIN=3.8。基于RIN值,作者选择5个时间点(0小时、12小时、24小时、48小时和84小时)采集20个样本,这些时间点跨越了RNA质量的整个尺度。
根据作者的实验结果,提取部分结论。
1.RNA降解的对转录组基因表达聚类的影响。基于15个样本的Spearman相关图,横纵坐标分别代表RIN值和样本名,发现聚类结果与处理时间密切相关,与 RIN 值的相关度不大。但低RIN值的样本聚集在一起,高RIN值的样本聚集在一起。高RIN值的样本的RIN值范围为6.3-9.4。
2. RNA降解对RNA-Seq的影响。RNA提取时间的延长导致RIN值降低,通常不会导致转录本的完全丢失(少于8%的转录本丢失),但许多转录本的相对表达水平会存在显著差异。如0小时(平均RIN为9.3)和84小时(平均RIN为3.78)的样本有61%的基因存在表达差异。
3. 关于RIN值的临界值。 如果使用一个简单的截止值,在RNA降解的情况下,组织样本的RIN值在7.9到6.4之间,在0小时到12小时之间基因表达的测量值差异很小,这可以从两个时间点之间被鉴定为差异表达的基因的数量很少得到证明。