上一期介绍了多重qPCR中如何验证性能及Tm的优化，本期迎来了MIQE的最后一个部分——数据分析，该部分的内容较多，大概需要5-6期的内容来完成。
数据分析软件
目前，能够用于qPCR数据分析的软件数不胜数，除了仪器厂家提供的商业软件之外，还有很多免费的第三方软件及网站，如SATQPCR Website[1]，这是个免费的数据分析网站（Fig 1），我之前在丁香学术上写过一篇推送专门介绍这个网站[2]，大家感兴趣可以参考。这个网站优势在于按照MIQE原则设计，用起来也比较简单；缺点就是交互性稍差，内容稍显单薄，而且输出的结果不易解读。不同的分析工具其算法和使用的模型可能是不同的，大家可能也有类似经验，同样的qPCRraw data在不同的软件甚至同一软件不同版本中得到不同的表达结果。因此，使用时要报告分析工具的名称、来源及版本。
Figure 1. SATQPCR web tool. 官方网址是http://satqpcr.sophia.inra.fr/cgi/home.cgi.
Cq决定方式
在最开始的几期推送中，我专门讲过Cq值的几种决定方式——Threshold method、Fit-point method和2nd DerivativeMaximum Method，它们有不同的适用条件和背景。总体来说，Thresholdmethod是应用最广泛的。绝大部分的数据分析软件都可以提供这三种方式，根据原始数据的情况灵活选择，并在文章中加以备注说明。
Outlier
通俗的讲，outlierdata就是“离群”的、“特立独行”的数据点。某个样品的三个技术学重复Cq值分别是30.2、30.5和32.9，那么32.9就是“疑似”的outlier，当然，真正的判断过程远没有这么主观、简单。qPCR实验中，outlier出现的原因很多，包括不具有代表性的取样、转录误差、操作不合格及测量误差等，因此出现outlier后要逐一排除可能的原因。Outlier是让很多qPCRer深恶痛绝的，辛辛苦苦忙了好几天的实验，最后就可能由于它的存在而拿不到统计学显著的结论，根本原因在于Outlier会直接导致mean的偏差及SD的增大。因此得到raw data后要对outlier进行确认并加以排除。
判断哪个数据点是outlier并非如上面的例子这样简单，仅仅依靠“眼力”和“感觉”肯定不可靠。第一种方法比较直观——箱线图，它给出的信息包括中位值、25%分位、75%分位和95%置信区间（Fig 2）。它假定normaldata的范围是[25%分位-1.5*(75%分位-25%分位), 75%分位+1.5*(75%分位-25%分位)]，超出此范围的就是outlier[3]。
Figure 2. 用于判断outlier的箱线图
第一种方法虽然简单明了，但内在逻辑性不强，难以解释其背后的统计学原理；第二种方法是ISO5725-2推荐的，采用Grubbs’ Test进行检验[4]，其统计量G= max | Cqi-MeanCq| / SDCq，通过查表可以得到p值，如果p<0.01，就判定是outlier；0.01<p<0.05，就判定是straggler（Tab.3）。Straggler一般不推荐删除，除非有特殊的技术学考虑；outlier可以删掉。显然，第二种方法有更深厚的理论依据。
Table 3. Grubbs’ test用于三个样本结果的outlier判定
无论采用哪种判断方法，都要加以备注，并注明对outlier的处理方式。要特别注意的是，3个技术学重复远远不足以判断outlier。一开始的例子中，不能因为32.9离mean最远就加以排除。碰到这种情况应该重复试验，并采用至少5个技术学重复。
NTC的结果
之前在qPCR性能指标部分讲过NTC。无论是染料法还是探针法，都要报告NTC的Cq值，并且NTC孔的数量要与样本的技术学重复保持一致。定性实验中，如果碰到NTC的Cq值小于40且污染原因不易排查的情况，要保证阳性对照和判为阳性的样本Cq值至少要比NTC小5个循环；更严格地，经过统计检验后再下结论。
下一期介绍数据分析的第二关，包括内参基因的选择及normalization。
参考文献
1. Rancurel, Corinne, et al. “SATQPCR:Website for statistical analysis of real-time quantitative PCRdata.” Molecular and cellular probes 46 (2019): 101418.
2. https://mp.weixin.qq.com/s/XiXsPV8mDErfMBSgU7zQHA
3. Tukey JW: Exploratory data analysisAddison Wesley Publishing, Reading; 1977. ISBN 0201076160
4. Burns, Malcolm J., et al. “Standardizationof data from real-time quantitative PCR methods–evaluation of outliers andcomparison of calibration curves.” BMC biotechnology 5.1 (2005): 31.
