上一期介绍了qPCR的评价指标，当然这些指标并不局限于qPCR，所有的定量分析技术都会用得到。本期介绍多重qPCR中如何验证性能及Tm的优化。
多重qPCR
很多qPCR实验都会用到多重反应，最典型的就是基因表达和SNP分析[1]。基因表达通常两重，一个靶标一个内参；SNP则可能多达四重反应，这与突变类型的种类相关。事实上，多重qPCR并不局限于常规的多色实验，还可以通过杂交产物的Tm来进行多重分析[2]，后面在介绍溶解曲线应用时会提及，本期仍然聚焦在常规的多重实验。
一般地，几重qPCR反应就意味着需要几对不同的引物和几条不同标记的探针，荧光标记与仪器的检测通道一一对应（Fig. 1）。实验设计时第一个关键问题就是引物探针的设计。因为多重反应都在同一个管里进行，使用同一个扩增程序，这就需要所有反应的最佳Tm相差很小，因此提高了引物和探针的设计要求。
第二个难题是确认几个反应是否有相互的影响和干扰，也是最容易出现的问题。这种影响可以从特异性和扩增效率两方面进行评估。首先，探针的特异性必须很好，尤其是SNP实验，只有一个碱基之差很容易导致错配。假设是一个四重反应，可以通过引物对A及探针B、C和D的组合来判断是否有错配发生。其次，扩增效率不能发生很大的变动，可以通过单重及多重的标准曲线加以评估。一般而言，由于多重反应对原材料的消耗较快，因此会对扩增曲线的平台期有较大的影响，但很少会影响指数期。
可能大家会有一个疑问，即便多重反应较大程度的降低了某个通道的扩增效率，比如从98%降到了70%，但其标曲的R2值很接近1，比如0.99，这种情况是否可以接受？首先要检查梯度范围是否够宽，如果足以覆盖所有的待测样本，且拟合度很高，那么这种情况就是可以接受的。事实上，较低的扩增效率往往伴随着拟合度的下降，在很大的浓度范围内，抑制程度一般不会一直维持在某个水平。
多重反应中，要报告每个反应的扩增效率及LOD水平（参考上期的内容），因此标准曲线是必须要做的。同时，要特别注意，如果丰度极低的靶标和较高的靶标同时检测，很可能会导致低丰度靶标的漏检，尤其是当其扩增效率不高时。
Tm值优化
这个方面之前提及过，在此仍然要强调，扩增效率的提高可以提升LOD水平，减少非特异性产物的产生，标准曲线的重复性及可信度也会提高；而Tm值优化是提高扩增效率最直接最简单的方法，只需要一台具有温度梯度功能的仪器，时间上可能还用不了半天。即便是这样，很多实验者仍然对其忽视。在此建议，将Tm优化纳入到预实验环节中，通过qPCR或者PCR+电泳的方法确认最佳的Tm值（Fig. 3），并加以报告。
这里提醒大家，软件预测的引物和探针的Tm值仅用于参考，而且最佳Tm随着反应环境的变化而变化，预测的准确度并没有预期的那么高，因此不能盲目迷信，最佳的Tm仍然要通过实验证据来确认。
Figure 3. 不同的Tm值导致不同的扩增效率。数据
来自于Bio-Rad。
特异性
之前也讲过特异性分析，但局限于前期设计预测，预实验时也要进行特异性分析的工作。区分是否是特异性的产物有很多方法，如电泳、测序、酶切验证及溶解曲线等，各有利弊。电泳比较简单，但只能分析片段大小；测序最权威，但耗时耗成本；酶切得找到合适的位点，且不利于分析太短的片段；更推荐的是溶解曲线，可以从片段长短及碱基组成两方面进行分析，且简单快速（Fig. 4）。
无论采用何种方法，都要报告分析结果，以便读者对实验的特异性有所把握。
下一期我们进入MIQE的最后一部分，也是比较难的部分——数据分析。
参考文献
1. Elenitoba-JohnsonKS, Bohling SD, Wittwer CT, King TC. Multiplex PCR by multicolor fluorimetry andfluorescence melting curve analysis. Nat Med 2001;7:249 –53.
2. Wittwer CT, Herrmann MG, Gundry CN, Elenitoba-Johnson KS. Real-time multiplex PCR assays.Methods 2001;25:430–42.
