上一期介绍了如何提供引物和探针的信息，本期的内容是与qPCR的mix体系及扩增程序相关的。
Mix体系
qPCR的体系配制其实与常规的PCR体系是类似的，也包含了buffer、dNTP、DNA聚合酶、引物及模板，不同的地方在于qPCR体系还多了荧光标记（如SYBR Green I或probe）。所有的组分都要提供浓度信息，这对重复qPCR实验至关重要。Buffer中除了缓冲成分，最重要的就是Mg2+，是DNA聚合酶活性的必要条件。DNA聚合酶除了浓度信息之外还要提供使用的聚合酶名称，如常规的Taq酶或者经过基因改造后具有更多其他特性的聚合酶，使用不同的酶做出的实验结果也不尽相同。引物的使用终浓度一般在100-600nM，探针的使用终浓度一般在200-400 nM。浓度太高易出现非特异扩增，太低则导致过低的扩增效率；因此最佳浓度要根据自己的实验来定，推荐前期预实验可以做一下浓度梯度的探索。
目前，大部分的qPCR实验都会选择使用各种kit，一般会提供2 x qPCR mix，里面预混了DNA聚合酶、SYBR Green I（染料法）、buffer、Mg2+和dNTP等，用户只需要加引物和模板即可。Kit说明书中一般不会提供各个组分的浓度信息，这种情况下，要备注kit的名称及生产厂家，同时，如果不是参照说明书中的配制方法，则要对改动的地方加以说明。
qPCR反应体系中有可能会用到各种添加剂，如DMSO、甜菜碱和BSA等，无非是要提高扩增效率或者反应特异性，如果用到添加剂也要备注工作浓度。值得注意的是有些添加剂对聚合酶是有毒性的，要在其正面和负面作用之间取得平衡，浓度梯度实验是有效的方法之一。
qPCR的反应体系一般在20-50 μl，常规采用20μl。尽量不要使用10 μl体系，加样不易控制且容易挥发，造成variation变大。
耗材及仪器
qPCR板材往往是实验者容易忽略的点。当采用96孔板时，要注意qPCR仪器的兼容类型：全裙边、半裙边及无裙边等。更推荐使用白色管而非透明管，这是因为白色对荧光的反射更彻底，反映在结果上是Cq值更小，从而一定程度上提高了检测的灵敏度，但要注意这对扩增效率是没有影响的[1]。唯一的弊端就是，看不到加样位置，也无法辨别是否有气泡，所以使用白色管时检测前要高速离心。
封膜也是要注意的细节，尽量采用热封，而不要使用粘性膜。手工封膜有可能密封不严，导致技术学重复之间的variation比较大[1]。
qPCR仪器种类繁多，国产的，进口的，深孔的，常规的，等等。要备注使用的仪器型号及生产厂家，这是因为不同的设备做出来的结果很有可能是不同的。特别要注意的是，不同设备做出来的Cq值是没有可比性的，不能通过单纯比较Cq的大小来评判设备的灵敏度等性能指标，而要综合标准曲线等其他因素来衡量。
扩增程序
qPCR程序与常规PCR程序基本相同，只是多了读板的操作。预变性一般采用95℃或者98℃，3-10 min即可，这里取决于模板的高级结构数量及GC%。循环步骤中采用两步法或者三步法，三步法的扩增效率相对较高，但当退火温度较高（>60℃）时，可将退火和延伸合并成一步，节省时间。对于qPCR产物而言，30-60s的延伸时间已经足够。无论采用两步法或者三步法，读板一般都是设置在循环的最后一步。循环之后一般无需终延伸和16℃保存等步骤，因为前面信号读取步骤已经结束了。
再次提醒大家，qPCR仪尽量不要使用4℃。两点原因，一是没有必要，DNA产物相当稳定，16℃足矣；二是长期维持4℃对qPCR制冷模块是很大的负担，会减少使用寿命，毕竟这不是冰箱。
下一期我们介绍qPCR的验证环节，再加上后面的数据分析，比较难的部分即将到来，敬请期待。
参考文献
1. Reiter M, Pfaffl M.Effects of plate position, plate type and sealing systems on real-time PCRresults. Biotechnol Biotechnol Equip 2008;22: 824–8.
