上一期介绍了如何提供完备的基因信息，本期的内容是相似的，只不过是对象换成了设计的引物和探针(如果使用探针法)。
序列信息
前面的推送中我们讨论过设计探针和引物的一些原则和示范，无论采用哪个工具进行的设计工作，都应该保留一些相关信息，如特异性分析等。当然，最重要的是引物和探针的序列信息，一般从5’端到3’端顺序书写。很多常见位点的引物和探针序列在RTPrimerDB网站上都可以查询的到，如人的ACTB（Fig 1）。每个基因可能不止一种设计方案，如人的ACTB就有50多种，探针法（TQ）和染料法（SYB）都在其中。具体选择哪一种方案要根据其文献出处（网站有提供）来比较和衡量，但大多数情况下都是通用的。推荐尽可能的采用已上传到该网站并得到验证的引物和探针序列，可以最大程度的保证扩增效果。当采用该网站上的方案时，要备注ID号（Fig 1中红框所示）。
Figure 1. RTPrimerDB中探针与引物的设计方案示意
当采用预制的assay（如乙肝病毒检测试剂盒）时，很可能无法提供详细的序列信息，因为这属于商业机密，公司一般不会提供。这种情况下，要在文章中备注使用assay的全称、货号及生产厂家。
匹配位置及修饰信息
设计好引物和探针后，一般要对其匹配的位置进行描述或者画图示意（Fig1中绿框所示），以方便读者一目了然。
引物的修饰方式有很多，如地高辛标记、生物素标记和氨基修饰等，但一般是用于非放射性免疫分析及杂交等实验。在常规的RT-qPCR实验中，通常不会对引物进行修饰。探针最主要的修饰信息是5‘端的荧光基团和3’端的淬灭基团，荧光基团的选择要根据仪器通道配置来选择，淬灭基团的选择要根据荧光基团的发射光谱，可以最大程度的降低背景荧光值。另外，为达到特定的应用效果，探针的碱基也有可能发生修饰，如对SNP位点进行PNA或LNA核酸类似物置换，从而降低错配发生概率。
生产厂家及纯化方式
有人可能认为国外厂家合成的引物或者探针质量比国内厂家要好，其实有些以偏概全；就RT-qPCR而言，对引物和探针质量的要求并没有像其他应用那么高，无论国产还是进口，绝大部分情况下应该都是可以满足的。如果你碰巧国内厂家合成的没有扩出来，国外厂家合成的成功了，那也只能说明你的“运气”太好，不足以得出质量差别的结论。事实上，现在大家更看重货期，这时国内合成公司就占有很大优势。
纯化方式有很多种，如脱盐、PAGE和HPLC等，在引物或者探针合成单上有标注。一般脱盐纯化的引物即可满足qPCR实验，如果不那么看重成本（其实也没有贵多少），更推荐使用PAGE纯化，纯度更高一些。探针尽量选择PAGE纯化。
下一期介绍qPCR的实验条件，除了引物和探针，还有更多的组分值得关注。
