今年的新冠疫情已在全球造成426万人感染，近30万人死亡。从目前的疫情走势、治疗和预防的棘手程度来看，这次新冠疫情绝对算是近代以来最严重的一次公共卫生危机。
5月11日，Nature报导FDA紧急批准了第一个CRISPR检测试剂盒，用于缓解美国目前公共检测的紧急需求(Fig 1)。该试剂盒是由Sherlock Bioscience公司开发，也是基于核酸检测，但这次并不是靠依赖DNA聚合酶的PCR反应，而是依靠CRISPR-Cas相关的酶。
Figure 1.Nature报导的美国第一个CRISPR新冠检测试剂盒
要了解这个试剂盒有何新颖之处，其检测性能表现如何，还是要从其技术原理谈起；事实上，这不是一个新技术了，Broad研究所的张峰实验室在2017年最早提出这一技术，并取名“夏洛克”[1]，意为能从大量“群众分子”中揪出个别“犯罪分子”的神探。光听名字，其灵敏度就低不了。
技术起底
这个技术的主角是CRISPR-Cas13a(也叫C2c2)，它携带着“犯罪分子”的特征信息(crRNA)，一旦与靶标分子匹配(序列互补配对)，它会行使核酸酶活性，无差别的水解RNA探针，从而释放出荧光基团发出荧光(Fig 2)。
Figure 2.Sherlock原理示意图
这个原理是很好理解的，但存在的问题是，如果靶标分子太少，cas13a得水解多少探针才能释放出足够的荧光信号？于是在前处理时加入了RPA等温扩增的程序，用于提高靶标分子的数量，同时文章中也比较了预扩增对灵敏度的影响，接近7-8个数量级的差异(Fig 3)，由此可见预扩增的必要性。与此同时，由于预扩增，这个技术只能进行定性检测。事实上，公共卫生中的病毒检测也不需要精确定量。
Figure 3. 预扩增对于检测灵敏度的影响。Cas13a数据点即
不进行预扩增的情况。
说到底，Sherlock就是预扩增加cas13a识别后切割的技术组合，RNA和DNA都可以检测。预扩增之所以选择RPA技术，主要是考虑到现场检测的便利性，可操作性强。
性能指标
灵敏度测试 文章中以寨卡病毒为例对Sherlock进行测试，以人血清或尿液作为样本，可检出低至2.1 aM的寨卡病毒RNA，即1.25 copy/μl的浓度(Fig 4)。这个灵敏度已经非常可观，甚至优于qPCR的灵敏度，完全可以满足公共卫生的日常检测。
Figure 4.Sherlock对样本中寨卡病毒的检测
特异性测试 设计上最大的难点在这里，因为要测试Sherlock对碱基错配的容忍程度。作者为降低容错率，特意在crRNA中引入单碱基突变，测试不同长度crRNA及不同位置的单碱基错配对WT(ssRNA1)和MT(ssRNA2)识别的影响(Fig 5)。可以看出每个长度crRNA的关键碱基位置都是3’端5号位碱基，同时20-23nt的长度都是合适的。因此在设计上，要将重点区分的单碱基位置放置在3号位，同时在5号位上人为引入突变。接下来以近源的寨卡病毒毒株和登革热病毒毒株为例，对特异性进行测试，Sherlock也展现出良好的区分能力。
Figure 5. 不同设计的Sherlock的对SNP片段的区分识别能力
优势劣势
Sherlock的优势显而易见：I. 灵敏度特异性足够的好，这是前提；II. 没有仪器硬件要求，非常适合现场检测，这是应对公共卫生事件进行普筛工作的一大优势；III.酶及试剂为干粉状，适合长期保存而无明显效力损失；IV. 可做成试纸条，人人可进行操作，如同测早早孕一样简单。
要说其劣势，那就是前期开发的难度较大，需要测试不同的crRNA设计。要知道，寨卡病毒检测试剂盒的设计思路，未必一定适合COVID-19。不同的序列，不同的样本类型，可能带来更多的挑战。这次的COVID-19检测试剂盒并没有披露其具体的性能指标，而且近几个月如潮水般涌现的qPCR检测试剂盒相对更容易开发，但也并没有展现出和厂家宣传一样的性能，因此我也对Sherlock检测试剂盒持谨慎乐观态度，只能说以观后效了。
继承发展
2018年，同样来自于张锋实验室的Gootenberg等人在此基础上开发了第二代Sherlock，最大的特色是利用不同cas13a及cas 13b蛋白家族成员的特点实现了多重检测(Fig 6)[2]。同年，Daniel S. Chertow回顾了利用CRISPR-Cas蛋白家族开发的一系列核酸检测工具，在传染病等临床检测及诊断中具有很好的发展前景[3]。2019年，张锋实验室发表了Sherlock开发设计的step-by-step protocol，为其他研究者提供了依据和参考[4]。
Figure 6.Sherlock version 2原理示意图
新颖工具酶的出现和开发，极大的推动了分子生物学的变革与进步，直到今天我们仍在受益。Sherlock，这是一个未来可期的技术，让我们拭目以待。
参考文献
1. Gootenberg,Jonathan S., et al. “Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2 “Science 356.6336 (2017): 438-442.
2. Gootenberg,Jonathan S., et al. “Multiplexed and portable nucleic acid detectionplatform with Cas13, Cas12a, and Csm6.” Science 360.6387 (2018): 439-444.
3. Chertow,Daniel S. “Next-generation diagnostics with CRISPR.” Science 360.6387(2018): 381-382.
4. Kellner,Max J., et al. “SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPRnucleases.” Nature protocols 14.10 (2019): 2986-3012.
