本期讨论反转录反应中引物策略、反应条件及样本保存三个要素。
引物策略
反转录酶与DNA聚合酶一样，都需要“引子”来启始反应。反转录反应中使用的引物分为三种类型：Oligo dT、随机引物和特异性引物，需要根据实验类型与需求灵活选择。
Oligo dT是由一系列重复T碱基组成的寡核苷酸单链，长度一般在15-20 nt，常用的是16或者18，写作Oligo dT16和Oligo dT18。这种类型的引物适合真核生物的mRNA反转录，因为其后面有长长的poly A尾巴，但对于tRNA、rRNA以及原核生物的RNA是无能为力的。同时，由于是反转录的起始位点都在mRNA末端，如mRNA很长可能无法生成完整的cDNA链，因此要求PCR扩增位点尽可能设置在末端。对于新手而言，最先接触到的也是最常用的应该就是Oligo dT，但很多时候也存在滥用的情况。
随机引物是一系列不同引物的混合体，每个碱基位置都有四种可能的选择，长度一般是6 nt或者8nt，即便长度很短，其引物的种类数量也是惊人的。随机引物的优势就在于随机性和种类数量庞大，适用于所有类型的RNA，尤其是当靶标RNA丰度很低或者存在二级结构时，随机引物的优势更为明显。使用随机引物要注意的是加量，每5 μg总RNA一般推荐50-100 ng的用量，加入太多会出现小片段产物过多，长片段产物过少。
特异性引物也就是下游qPCR反应用到的一对引物，同样也可用于启始反转录反应，只产生需要的cDNA，因此能够保证后续的qPCR反应更特异。但有时候，仅靠特异性引物无法有效的引导cDNA合成，效率太低，因此不得不选择前面两种引物类型。
Figure 1. 三种引物策略的示意图
不同的引物策略当然会导致不同的cDNA构成，进而影响Cq值；同样的，适用于所有实验条件的引物策略也是不存在的，因此在正式实验前也要评估不同引物策略的启始效率。如Tab. 2所示，五个靶点采用不同的引物策略得到的Cq值是有差异的，Glut2基因甚至能查到4个循环以上；从cDNA产量角度评价，β-tubulin及Insulin II宜采用Oligo dT，CaV1D和GAPDH宜采用随机引物[1]。
如果采用一步法，那只能选择特异性引物进行反转录；如果采用两步法，那三种引物策略都可以使用，一般更推荐Oligo dT和随机引物混合使用，可以使mRNA各部分都以相同效率进行反转录，提高下游qPCR数据的重复性。最后，方法中要备注采用的引物策略及使用量。
反应条件
这里的反应条件指反转录体系的组分构成、反应温度和反应时间。反应温度要看使用的反转录酶的最大活性(一般42℃-50℃)，反应时间要参考RNA的加量。如果使用反转录试剂盒，一般参照说明书来进行设置。
样本保存
无论是保存RNA还是cDNA样本，一定要避免反复冻融，建议分装成合适体积后再保存；RNA样本容易降解，必须要冻于-80℃，且不要超过3个月。即便这样，也并不能保证没有降解，复苏后仍然要对RNA完整性进行评估；另外，保存溶液最好选用商品化的storagebuffer，或者用乙醇/异丙醇沉淀的形式保存，效果会更好。cDNA则要稳定得多，保存于-20℃即可，但也不要超过6个月，如要保存更长时间，尽量保存于-80℃。
下一期讨论下游qPCR的靶点信息，这同样会对实验的重复性造成影响。
参考文献
1. Ståhlberg,Anders, et al. “Properties of the reverse transcription reaction in mRNAquantification.” Clinical chemistry 50.3 (2004): 509-515.
