要论近几年生命科学领域最“火”的技术，除了基因编辑之外，大概就要算单细胞RNA测序（scRNA-Seq）了。它的作用大了去了，可以找到新的稀有细胞群体，加深对群体异质性的理解，也可以揭示细胞分化及对治疗方法产生应答的内在机制。然而，药物作用的初始靶点一般都是蛋白质，而且mRNA水平与蛋白水平并不是一一对应的[1]，因此为了更客观的描述细胞动态变化和响应，将蛋白质定量加入scRNA-Seq中是有必要的。
RNA expression and protein sequencingassay(REAP-Seq)的建立提供了一个可能的解决方案[2]。这篇文章虽然是2017年发表的，但对于设计思路的开阔、技术路线的补充仍然有很好的启示意义，所谓温故而知新，就是这个意思吧。比如SHERLOCK技术的建立也是2017年的事情[3]，但同样可以为新冠病毒的高灵敏快速检测方法的探索提供可能的参考和借鉴（相关产品已经推出）。
Figure 1. REAP-Seq方法的发表
REAP-Seq的原理流程
REAP-Seq包括mRNA-Seq和protein profiling两部分，scmRNA-Seq采用比较成熟的microfluidic + cell barcoding的方式，生成droplet包裹单细胞和用于后续建库的bead，即经典的Drop-Seq原理(Figure 2)[4]。
Figure 2. Drop-Seq的流程
最大的创新点在于protein profiling。众所周知，检测单细胞蛋白表达最常用的是流式细胞术，但受限于荧光补偿和通道数量，所以一次可检测的靶标蛋白种类是有限的（一般小于30种），质谱流式技术可将检测数量提高到近50种，但对于更深入理解蛋白组水平仍然是不够的。传统流式细胞术是通过将蛋白信息转换成相应荧光素的光谱信息，质谱流式则转换成重金属的质量信息，从而通过质谱取得更佳的分辨率；既然要兼容RNA-Seq的建库和测序流程，那就可以考虑将蛋白信息转换成相应的DNA序列信息。
将mAb的Fc段链接上一条寡核苷酸单链，PCR handle是文库扩增和测序位点，Ab Barcode用于标记不同的mAb，与RNA-Seq中的Cell Barcode类似的功能，是mAb的身份证。8 bp的AbBarcode理论上可以标记48种蛋白marker，检测通量拓展了很多倍。末端的poly A与细胞中的mRNA类似的结构，以便被bead上的poly T捕获。
Figure 3. REAP-Seq的流程
细胞首先与加标签的抗体一起孵育，接下来洗掉未结合的抗体（关键步骤，影响测序质量），这样表面带有抗体的细胞就进入Drop-Seq流程。反转录后细胞mRNA文库和protein assay文库是分别构建的（根据大小进行核酸纯化），同时protein assay文库中要加入核酸外切酶I消化掉过量的单链Cell BC以避免Ab BC与其它细胞的Cell BC发生交叉反应。
REAP-Seq的测试
为了初步验证REAP-Seq的效果，以常规的PBMC作为研究对象，使用了45种蛋白marker，t-SNE分析得到了8种细胞群体（Figure4a）。同时，以磁珠纯化的三种细胞——CD3+ T cells, CD11b+ myeloid cells,and CD19+ B cells的数据（not shown here）为对照，分别分析mRNAassay和protein assay的灵敏度和特异性（Figure 4b）。转录表达水平最高的三种靶标——HLA-DR, CD20和CD14，mRNA和protein两种分析的相关系数也是最高的；CD4的相关系数很低，而且在monocyte中也有表达，这在流式分析中得到印证（Figure 4c）。另外，CD56, CD158e1, CD19, CD33, CD11b和CD155这几个marker，proteinassay的灵敏度显然要比mRNA assay高，原因可能是其转录物半衰期太短。
Figure 4. PBMC的REAP-Seq及流式分析结果
当然，由于使用的蛋白marker的数量限制（抗体种类远远比不了转录物的种类），mRNA assay也能起到了很好的补充，通过对转录组的分析找到plasmacytoiddendritic cells (LILRA4, SERPINF1), megakaryoctyes (PF4)和FCGR3A+monocytes (FCGR3A)三种细胞群体（Figure 5），而这些细胞的marker并没有包含在这次的mAb Panel里。
Figure 5. 三种细胞的mRNAassay
REAP-Seq的应用
有研究报导，动物模型试验中anti-CD27 mAB可以激活免疫系统产生抗肿瘤活性[5]，可采用REAP-Seq对anti-CD27 mAB对naïve CD8+ T cells的激活效应做深入研究，使用了80种protein marker。从三位受试者血液中提取naïve CD8+T cells，分别采取两种刺激方式（Figure 6）。
Figure 6. Naïve CD8+ T cells的两种刺激方法
尽管protein marker数量远远少于mRNA，但仍然能够展示出untreated和treated之间群体明显的界限（Figure 7a）。当mRNA assay同样只采用protein panel中的69种marker时，却并没有明显的分群界限（Figure7b）。
Figure 7. Protein assay和reduced-genes mRNA assay的对比
对比untreated和treated的三个样本，mRNAassay揭示了74个差异化表达的基因，包括预料中的细胞增殖相关的MK167，同时也有预期之外的MALAT1, SYNE2, LST1和TK1。一种非编码RNA，MIR155HG也位列其中，这也是proteinassay无法检测到的。Protein assay找到了16个差异化表达的marker，同时发现有相当的CD8+ T cells在刺激后表达了CD4和CD25，后在流式分析中得到印证。
总结
对比mRNA assay和protein assay，可以看到protein assay在低丰度marker的检测上更有优势，原因可能是蛋白的半衰期更长。同时，由于mAb上可以链接多条DNA元件（此次试验中使用的是平均一个抗体蛋白上有三条单链），因此信号可以放大很多倍，这也提高了检出灵敏度。
参考文献
1. Albayrak, Cem, etal. “Digital quantification of proteins and mRNA in single mammaliancells.” Molecular cell 61.6 (2016): 914-924.
2. Peterson, VanessaM., et al. “Multiplexed quantification of proteins and transcripts insingle cells.” Nature biotechnology 35.10 (2017): 936.
3. Gootenberg,Jonathan S., et al. “Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.”Science 356.6336 (2017): 438-442.
4. Macosko, Evan Z.,et al. “Highly parallel genome-wide expression profiling of individualcells using nanoliter droplets.” Cell 161.5 (2015): 1202-1214.
5. Roberts, Drew J.,et al. “Control of established melanoma by CD27 stimulation is associatedwith enhanced effector function and persistence, and reduced PD-1 expression,of tumor infiltrating CD8+ T cells.” Journal of immunotherapy (Hagerstown,Md.: 1997) 33.8 (2010): 769.
