近十几年来，长链非编码核糖核酸(Long non-coding RNAs，简称：lncRNA)的研究热度只增不减。在国自然基金中，lncRNA的中标几率不断攀升，成为国自然日益显著的研究热点之一(图1)。
图1 以lncRNA为关键词，历年中标的项目数
lncRNA是指长度大于200核苷酸的非编码RNA。国内外研究者对该领域的关注度日益增高，近年来研究表明lncRNA在基因转录调控、基因转录后调控、表观遗传调控等众多生命过程中发挥重要作用。lncRNA的异常表达与包括癌症和心血管疾病等多种疾病密切相关，因此提供了新的生物标志物和药物靶点。本文将概述lncRNA发挥生物功能的作用机制, 并介绍开展lncRNA研究的方法。
lncRNA的特征
lncRNA最基本的特征是长度大于200核苷酸(200核苷酸~100k核苷酸)、无蛋白质编码功能，哺乳动物全基因组的4%~9%可转录成lncRNA。lncRNA有一些类似于mRNA的特征，如绝大多数lncRNA拥有5’帽子结构和3’polyA尾巴，由RNA转录酶Ⅱ转录，并经多聚腺苷酸化、pre-RNA拼接在内的共转录修饰。同时，与编码RNA相比，哺乳动物中的lncRNA具有更少外显子，缺少开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)及典型的起始密码子和终止密码子，这可能是lncRNA不能编码蛋白质的原因。lncRNA在细胞质、细胞器、细胞核中均有分布，主要存在细胞核内。lncRNA在物种内序列进化保守、表达量易受外界环境影响，物种间的序列保守性较差，丰度也低于mRNA。lncRNA的组织特异性远强于蛋白质编码RNA，不仅不同组织间的表达量不同，甚至同一组织不同部位的lncRNA都存在不同的表达模式。此外，lncRNA具有很强的时空特异性，同一lncRNA的表达量在同一组织或器官的不同发育阶段均有较大差异。
lncRNA的分类
lncRNA的二级、三级结构复杂，功能多样。根据lncRNA与蛋白质编码基因的位置关系, 可将它们分为重叠型、顺式反义型、双向型和内含子型等；而根据lncRNA的功能, 则可将其分为信号分子(Signal molecule)、诱饵分子。
lncRNA的功能
研究表明，lncRNA在基因转录调控、RNA加工、细胞凋亡、染色质修饰、端粒维护、蛋白质与蛋白质或DNA与蛋白质交互作用的调控等生物学过程中扮演重要角色。但与miRNA相对单一的作用机制不同，lncRNA的功能较复杂，目前主要分为5类。
3.1 调节组蛋白修饰与染色质重塑
染色质的状态是转录活性的关键决定因素之一，涉及核小体结构和组蛋白修饰等。lncRNA可通过招募染色质或组蛋白修饰相关蛋白形成作用复合体，之后到达目标位点，并促使该位点上的基因序列上发生表观遗传修饰，调控下游基因表达。SCMX蛋白、CoREST/REST及PRC2复合体是重要的染色质重塑相关蛋白，全基因组分析表明，大约1/3基因间lncRNA都涉及PRC2复合体、CoREST/REST或SCMX蛋白。最典型的例子是lncRNA-RepA可招募PRC2到Xist基因启动子，引发Xist启动子的组蛋白H3第27位赖氨酸发生甲基化(H3K27me3)，最终导致X染色体失活(图2)。lncRNA-HOTAIR则是作为一种反式调控，通过招募PRC2形成复合体，远距离介导HOXD发生H3K27的三甲基化(H3K27me3)，抑制相关基因的表达。lncRNA-Firre 可通过绑定CTCF对细胞核周围不活跃的X染色体定位，维持H3K27me3处的甲基化水平。lncRNA-ADINR由C/EBPα基因上游450bp位置转录而来，在脂肪生成过程中可特异性地结合PA1，招募MLL3/4组蛋白甲基转移酶，增加C/EBPα位点的H3K4me3，最终减少H3K27me3组蛋白修饰，它的损耗可导致严重的脂肪形成缺陷。而lncRNA-Air通过招募组蛋白甲基化转移酶G9a到Igf2启动子区域，使组蛋白H3K9发生甲基化，最终沉默父源染色体提供的相关印迹基因的表达。
图2 lncRNA招募PRC2介导H3K27me3
3.2 影响其他RNA生成
mRNA由miRNA的前前体 pre-miRNA 及前体 pri-miRNA 剪接而来，许多蛋白质已被证明可直接与Dicer和Drosha互作或绑定miRNA前体去调控pri-miRNA或pre-miRNA的生成。而lncRNA可通过调节RNA聚合酶Ⅱ的活性来调节RNA的生成。lncRNA-FGFR2通过招募多硫蛋白和脱甲基酶KDM2a建立特异性剪接的染色质信号，调控可变剪接。RNA聚合酶Ⅱ是通用转录因子，由SINEs转录而来的lncRNA-Alu和lncRNA-B2可直接抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性来改变转录起始复合体的构象。而在RNA结合蛋白HEXIM1的参与下，lncRNA-7SK可与P-TEFb形成复合体，降低P-TEFb活性及磷酸化。此外，源于假基因的转录本也可引起部分具有蛋白质编码功能的mRNA形成小RNA分子，如同样源于假基因的反义lncRNA能和与之相应的、被剪接的mRNA杂交，并经Dicer酶裂解形成内源性siRNAs。因此，假基因并非没有功能，当其作为lncRNA转录时，也可作为调控基因表达的关键因子。
3.3 lncRNA 在翻译调控中的作用
lncRNA也在基因翻译水平发挥表达调控作用。β-分泌酶1反义转录物(BACE1-antisense transcript，BACE1-AS)是β-分泌酶1(β-site APP cleaving enzyme1, β-secretase 1, BACE1) 基因的天然反义转录物(Natural antisense transcript)。如果BACE1-AS与正义BACE1 mRNA相结合将增强BACE1 mRNA的稳定性，从而增加BACE1 蛋白的表达量，BACE1蛋白通过切割β淀粉样肽前体，产生更多的β淀粉样肽。由于脑内存在很多β淀粉样肽斑块是老年痴呆症的一个显著特点。因此, Faghihi等认为BACE1-AS直接参与老年痴呆症的病理过程。此外，lincRNA-p21也参加翻译调控，当细胞中缺少一种称为人类抗原R (Human antigen R, HuR) 的RNA结合蛋白时， lincRNA-p21在细胞中稳定存在并且不断积累，可与靶mRNA结合从而抑制后者的翻译。
3.4 作为竞争性内源RNA(ceRNA)
在2011年研究者提出的内源RNA(ceRNA) 假说指出，当circuRNA、mRNA等具有miRNA应答元件(miRNA response element，MRE)时，它们会竞争性地结合MRE而调控相关基因的表达。lncRNA也是一种竞争性内源RNA，能与其它RNA转录体竞争，进而在转录后水平上间接调控miRNA参与的生物学过程。但与其它ceRNA不同的是，lncRNA与miRNA的作用机制主要有两种。lncRNA可直接与miRNA种子序列互补配对，吸附miRNA形成复合体，降低细胞内参与下游基因调控的miRNA数量。例如，肌肉特异性lncRNA-MD1可吸附miR-133、miR-135，进而调节肌肉特异基因的转录激活因子MAML1、MEF2C，影响肌肉分化；lncRNA-APF与miR-188-3p的种子序列互补，间接调控miR-188-3p的靶标ATG7的表达量，参与细胞自噬和心肌梗死的发生。而当lncRNA序列里包含miRNA的种子序列时(如lncRNA序列内含有可与miRNA竞争，结合靶mRNA的3’UTR)，lncRNA也可作为ceRNA发挥功能，如lncRNA-Sirt1序列包含miR-34a的种子序列 (TGGCAGT)，可竞争性地结合miR-34a的靶标。
3.5 lncRNA 在细胞凋亡和细胞周期调控中的作用
lncRNA也具有调控细胞生长的作用，这主要是通过调控细胞周期和细胞凋亡来实现的。例如，Huarte等发现p53 可直接诱导长链基因间非编码RNA p21(Long intergenic ncRNA p21，lincRNA-p21)的表达。lincRNA-p21与核不均一核糖核蛋白-K(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-K，hnRNP-K) 相互作用后可抑制p53信号通路下游基因的表达，从而调控p53介导的细胞凋亡。
lncRNA的研究方法
为揭示 lncRNA 的分子作用机制，人们需要借助多种分子生物学研究方法。目前在 lncRNA 研究中使用较多的的研究方法包括：
4.1 RNA原位杂交(RNA in situ hybridization)
RNA原位杂交是利用标记过的反义RNA为探针，与切片杂交，从而原位地显示RNA的表达部位和相对丰度。RNA原位杂交是研究基因表达谱的重要方法，实验流程分为取材、固定、脱水、包埋、切片、探针合成、杂交。
4.2 ChIRP(chromatin isolation by RNA purifications)
这是一项通过纯化RNA分子从而获得其结合的染色质片段(包括RNA结合蛋白与基因组DNA)的实验方法。大概流程：首先细胞交联，使lncRNA及染色质被固定连接；随后通过超声破碎将染色质打断，并使用带有标记的生物素oligos与长链非编码RNA分子杂交；之后利用亲和素磁珠纯化lncRNA及其结合的染色质片段；后续分析和测序。
4.3 lncRNA-DNA三联体的体外同位素检测
该方法可检测lncRNA-DNA的相互作用。在体外分别合成lncRNA和DNA片段，并用同位素(P32)标记，在体外做结合实验。如果不结合，那么就会呈现两条已知的条带，如果能够结合，那么就会有一条RNA-DNA分子量新条带出现。
4.4 RIP(RNA-immuno precipitation)
RNA免疫沉淀可以用来研究组织或活细胞中蛋白质和lncRNA之间的相互作用。该方法的原理是采用针对目标蛋白的抗体，把相应的lncRNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化，并对复合物上的lncRNA进行分析鉴定。RIP技术分别与Chip和RNA-Seq相结合而衍生的RIP-Chip和RIP-Seq技术，也广泛应用于lncRNA与蛋白质的相互作用中(图3)。
图3 RNA免疫沉淀
4.5 CHART(Capture Hybridization Analysis of RNA Targets)
也可以叫做RNA precipitation，根据lncRNA序列设计探针，二次探针交联在固相载体上。将核内RNA-DNA状态固定处理，染色质超声打碎成小片段，RNA-DNA的结构就可以被探针抓取下来，利用DNA-Seq对抓取的DNA进行测序，获得DNA结合序列的信息。
吉康医学小编结语
随着越来越多研究者关注并且投身到lncRNA研究领域中，人们对lncRNA的认识也进一步深入。lncRNA不仅在生物体中以多种机制发挥其生物学功能，其功能的失调与多种疾病的发生和发展有关。随着科学的进步, 将有更多的新技术运用于lncRNA的功能研究中，这将有助于我们进一步解析lncRNA的功能及其分子调控机制，以及它们在疾病发生与发展过程中的病理机制。
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