国自然专题:国自然的新宠——细胞外泌体

外泌体（Exosomes）是胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外的膜性小囊泡，是细胞间信号传输的载体。具有脂质双层膜，直径大约为30-150 nm。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞—细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。2013年，诺贝尔生理学或医学奖授予了三位科学家，表彰其在细胞间囊泡运输调控机制领域作出突出贡献，将外泌体研究的热度推向高潮。近几年外泌体成为科研热点，相关论文发表数量呈爆炸式增长，2018年外泌体相关SCI论文近2500篇，2019年截止到目前，外泌体相关文献已将近1000篇。

外泌体可以通过细胞外刺激、微生物攻击和其他应激条件的诱导等而生成。目前主流观点认为，外泌体产生过程为：细胞膜内陷，形成内体（Endosome），再形成多泡体（Multivesicular bodies，MVB），最后分泌到胞外成为外泌体。外泌体中携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息。

外泌体最早见于1981年，EG Trams等在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现了有膜结构的小囊泡，并命名为Exosome。对于外泌体的作用，当时推测为细胞排泄废物的一种方式。1996年G Raposo 等发现类似于B 淋巴细胞的免疫细胞也会分泌抗原呈递外泌体（Antigen presenting vesicle），所分泌的外泌体可以直接刺激效应CD4+细胞的抗肿瘤反应。2007 年H Valadi 等进一步发现细胞之间可以通过外泌体中RNA交换遗传物质。

几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于体液中，包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等。目前研究发现外泌体中富含核酸（microRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等）、蛋白、胆固醇等。外泌体的表面marker主要有CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP27等。

几乎所有的外泌体都有微管蛋白、肌动蛋白结合蛋白、四跨膜蛋白。由于其特殊的形成方式，外泌体不含有内质网内的蛋白质，而高表达细胞内源性蛋白质如Alix、Tsg101。不同细胞来源的外泌体蛋白组成存在差异，肠上皮细胞来源的外泌体含有多种代谢酶及肠组织特异性A33抗原，B细胞来源的外泌体富含CD86和MHC分子，T细胞来源的外泌体表面有促凋亡的FasL受体。Théry等通过MALDI-TOF-MS分析树突状细胞来源的外泌体，鉴定出跨膜蛋白(Mac-1 α chain、MHC-II β chain、CD9)、细胞质蛋白 (hsc73、annexin II、Gi2α)，膜外蛋白乳脂肪球上皮生长因子8(milk fat globule-EGF factor 8 protein，MFG-E8)为主要成分。外泌体通过其携带的蛋白质、核酸、酯类等来调节受体细胞的生物学活性，从而参与机体免疫应答、抗原呈递、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等生物学过程。

目前，外泌体作为生物标志物虽然还处于起步阶段。近年来，越来越多的研究表明，外泌体在肿瘤诊断、迁移生长、组织损伤修复、免疫抗原呈递及神经退行性疾病中起着极其重要的作用。科学家Belov等将已知的肿瘤表面标志物固定于芯片上，通过抗体芯片分别检测细胞与血浆中外泌体标志物，约40%的癌细胞表面标志物在囊泡表面体现，说明抗体芯片检测外泌体表面蛋白有望应用于肿瘤诊断。长期以来，对于外泌体的研究主要集中在研制具有特定靶向的抗肿瘤疫苗。但其抗肿瘤作用具体是增强免疫还是引起耐受，是促进增殖还是诱发凋亡，其内在的机制仍需深层次探讨。有研究发现，细胞表面蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1在胰腺癌个体血液外泌体中含量丰富。

随着对外泌体所含功能性蛋白、mRNA及 miRNA 等成分的研究，外泌体在体内信号转导中的作用也逐渐被认识。科学家Keller等通过RT-PCR分析羊水中的外泌体，发现外泌体存在编码ZFY(人类Y染色体的性别决定区编码一种锌指蛋白)的mRNA，可用于胎儿性别的判断。外泌体miRNA可作为肺癌的诊断标志物，科学家Taylor等发现卵巢癌患者与正常人血液外泌体的miRNA图谱有明显差异，说明外泌体有助于卵巢癌的诊断。此外分析尿样本中外泌体的蛋白图谱还可能协助肾脏疾病的诊断。外泌体在免疫、代谢、心血管疾病、神经系统疾病及肿瘤的诊断、治疗等中都扮演着极其重要的角色。同时，外泌体作为疾病治疗药物运送载体的研究也在不断发展。

1、Cell：脂肪组织巨噬细胞分泌的外泌体能够调节胰岛素抵抗性

由肥胖导致的慢性组织炎症是胰岛素抵抗性和2型糖尿病产生的一种根本原因。但是这种发生的机制在此之前一直是未知的。在一项新的研究中，来自美国加州大学圣地亚哥分校和中国医学科学院/北京协和医学院的研究人员鉴定出外泌体（Exosome）是其中缺失的一环。相关研究结果于2017年9月21日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity”。论文通信作者、加州大学圣地亚哥分校医学院内分泌新陈代谢内科医学教授Jerrold Olefsky博士说，“当外泌体在组织之间迁移时，它们诱导的反应可能是导致糖尿病中的代谢错乱的细胞间通信的一种根本原因。通过对细胞进行荧光标记，我们能够观察到外泌体和它们携带的微RNA（microRNA, miRNA）从脂肪组织经过血液，渗透到肌肉组织和肝组织中。”Olefsky团队获取在肥胖小鼠的脂肪组织中发现的巨噬细胞，并且收集它们分泌的外泌体。苗条的健康小鼠接受这些“肥胖的”外泌体的处理。他们发现尽管这些之前正常的小鼠并不会体重超重，但是它们也开始表现出肥胖诱导的胰岛素抵抗性。当逆转这种过程时，Olefsky团队发现当利用来自苗条小鼠的外泌体处理肥胖小鼠时，他们能够恢复这些肥胖小鼠的胰岛素敏感性。这些肥胖小鼠保持体重超重，但是在代谢上是健康的。类似地，在体外研究期间，当利用“肥胖的”外泌体处理人肝细胞和脂肪细胞时，这些细胞产生胰岛素抵抗性。相反地，当它们接受“苗条的”巨噬细胞外泌体处理时，它们对胰岛素高度敏感。

2、Nature：利用靶向KRAS突变基因的外泌体治疗胰腺癌

根据来自美国德州大学MD安德森癌症中心的一项新的研究，对外泌体进行基因操纵可能提供一种新的胰腺癌治疗方法。相关研究结果于2017年6月7日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer”。在这项新的研究中，经过基因修饰的外泌体（被称作iExosome）能够运送特异性地靶向KRAS突变基因的小RNA分子，从而导致胰腺癌模式小鼠病情缓解，增加它们的总存活率。这些研究人员采用了一种被称作RNA干扰（RNAi）的靶向方法：利用这些天然的纳米颗粒（即外泌体）运送小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）分子来靶向胰腺癌细胞中的KRAS突变基因，从而影响多种胰腺癌模型的肿瘤负荷和存活。他们证实外泌体能够作为一种高效的RNAi载体发挥作用，这是因为这些纳米大小的囊泡（即外泌体）轻松地在体内迁移和进入靶细胞（包括癌细胞）中。作为一种分子通断开关的KRAS发生突变时会处于“开启”状态。在80%～95%的胰腺导管腺癌（PDAC）当中，这个基因发生突变，这也是这种癌症中最为常见的突变。这些研究人员证实iExosome能够运送特异性地靶向KRAS的siRNA和shRNA分子，并且比他们的合成对应物脂质体（Liposome）更加高效。脂质体不具有外泌体表现出的天然复杂性和优势。这些研究人员也证实一种被称作巨胞饮（Macropinocytosis）的细胞过程促进发生KRAS基因突变的癌细胞摄取外泌体。巨胞饮参与细胞清除营养物和囊泡。 

3、外泌体lncRNA促进肾癌肿瘤细胞耐药性

肿瘤学期刊Cancer Cell（IF：27.409）发表文章，阐述了疾病相关lncRNA参与肾癌耐药性及通过外泌体传播的生理机制，将外泌体lncRNA的研究又一次带到了大众视野中。首先作者通过高通量手段检测了野生型细胞和耐药型细胞中差异表达的lncRNA，并通过病人源性异种移植模型(PDX)鉴定到8条疑似致病lncRNA。将其中一条lncRNA-lncARSR (Activated in RCC with Sunitinib Resistance)敲除后，细胞耐药性明显增强。进一步研究表明lncARSR与肾癌细胞增殖、粘附等表型密切相关。作者研究发现，lncARSR主要存在于细胞外泌体中，并且耐药细胞外泌体lncRNA含量要远高于野生型细胞。作者随后通过RNA Pull Down实验证实核不均一性核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)负责包埋lncARSR进入外泌体。当提取耐药细胞外泌体孵育到野生型细胞后，野生型细胞胞内lncARSR含量增加，细胞耐药性增强。而胞内lncARSR主要发挥miRNA海绵功能，通过竞争性结合miRNA-34和miRNA-449，促进AXL和c-MET表达及下游STAT3、AKT、ERK信号通路的活化，终导致舒尼替尼耐药性形成。原文：Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA.

4、大脑创伤小鼠脑组织来源外泌体环状RNA表达

大脑创伤（TBI）具有极高的发病率和致死率，不同程度危害身体健康，目前对其致病机理，尤其是对神经系统造成伤害的分子机制尚不知晓。已知外泌体中富含环状RNA，一类新发现的环形非编码RNA，多数以miRNA海绵机制调控下游功能基因的表达。近日，Journal of Neurotrauma（IF=5.190）发表文章，研究了大脑创伤小鼠模型脑组织来源外泌体环状RNA的表达图谱，并对其功能进行了预测。作者首先分离小鼠脑组织，提取脑周质外泌体，依托二代高通量测序技术手段，进行了外泌体全转录组测序。作者共发现231个差异表达的环状RNA，155个上调，76个下调。通过GO及KEGG分析对其中外泌体环状RNA进行了功能预测。GO分析表明这些RNA分子主要参与神经损伤修复，神经系统发育及神经信号传导相关，这些分子同时主要富集在cGMP-PKG信号通路。circRNA-miRNA互作网络图揭示了环状RNA作用靶miRNA及可能的功能。本文研究了大脑创伤外泌体中环状RNA变化，为后续分子机理详细研究提供诸多靶分子。原文：Circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice.

说完了外泌体的历史，接下来，结合国自然基金申请我们来聊聊关于外泌体的研究新思路。

从最早发现外泌体到现在，国内外已有5000多篇外泌体相关研究，特别是2010年起，外泌体的研究明显提速。我们从图4中可以看到2019年国家自然科学基金获批项目中，外泌体研究相关项目总数500多项，比2018年增加了70多项。而图5中2019年外泌体立项总金额突破2亿元，比2018年高4000多万元！从这个趋势来看，外泌体国自然立项必将持续走高。那么，2019年获批的外泌体研究项目都集中在哪些研究方向呢？

从统计来看，与前年相似外泌体立项最集中的领域还是肿瘤学，近年来外泌体发表的文章也大多与肿瘤耐药性，检测等方面有关。例如2019年发表在Molecular Cancer（IF=10.679）上的文章表明外泌体FMR1-AS1通过TLR7/NFκB/c-My信号通路在女性食管癌中促进维持癌症干细胞样细胞的动态平衡。发表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=5.646）上的一篇文章发现外泌体转运p-STAT3可促进结直肠癌细胞获得性5-FU耐药性。发表在Cancers（IF=6.162）上的一篇文章则研究了腹腔灌洗液中细胞外囊泡相关的miRNA作为子宫内膜癌分子标志物的可能性。此外，在神经系统和精神疾病，中医学及其他领域也有不少外泌体相关项目中标。

由于外泌体的主要功能被认为是细胞之间的信息传递，那么了解它带有的蛋白质和多种RNA上的信息就变得尤其重要。2019年外泌体中标项目中带有热门话题miRNA、lncRNA和环状RNA的项目数量如（图6）所示。我们可以看到，外泌体中的miRNA和lncRNA过去研究的是比较多，例如发表在Hepatology（IF=14.971）上的一篇文章表明肝癌细胞释放的外泌体miRNA调控巨噬细胞程序性死亡配体1的表达。另一篇文章发现胆管细胞来源的外泌体LncRNA H19促进肝星状细胞活化和胆汁淤积性肝纤维化。相对的，外泌体中的circRNA研究目前还较少，而circRNA分子自身独特的稳定性、组织特异性、时序和疾病特异性等，使它很有可能成为外泌体检测的下一个热门研究的分子。另外，从2019年外泌体基金中标金额可以看到外泌体的研究开始与应用联系起来，与2018年项目金额前10的全部是分子机制的研究相比，2019年关于外泌体临床应用的项目也能跻身前五。所有中标项目中，项目类型依然十分广泛，从重点重大项目到青年科学项目均有外泌体相关研究。

很多科研小伙伴对于外泌体的研究，还是有些疑虑的，不知道自己养的细胞能不能做外泌体研究，其实不用担心，外泌体已知是细胞之间传递信息的信使，细胞没有独立存在的，任何表型的改变（肿瘤侵袭，干细胞修复，组织再生，胚胎发育等）都是经过细胞传递，外泌体介导的。那么外泌体课题如何设计更加新颖呢？吉康医学科研团队也给大家一些建议干货：

外泌体研究通常与高通量测序的联系最为紧密，研究思路可以分为三大类：表达谱、分子标志物和分子机制方向，其中表达谱思路的特点就是短平快、通常以测序数据为主要内容，短平快发表3-5分文章。而分子标志物的特点是在表达谱基础之上加入大量样本验证，建立ROC、KM曲线，分析分子与临床疾病的相关性为主，通常文章影响因子在3-10分之间。最后是分子机制研究，顾名思义要做到细胞功能、机制研究深度，因此工作量通常较大，影响因子通常能够上10+。

另外，大家也要选择一个靠谱的合作品牌，相信吉康医学的科研一站式服务是你的不二选择。你只需提供体液样本，我们将为你完成从外泌体提取、外泌体鉴定、外泌体全转录组测序、RIP、RNA pull-down、双荧光素酶报告实验到数据分析整套服务流程。

老话说“物以稀为贵”，生活如此，科研亦是如此。外泌体国内研究起步较晚，到目前为止依然是发展中阶段，所以越早开展外泌体机制实验，咱们才能越快的搭上国自然的顺风车；再加上咱们的研究数据作为硬核保障，相信国自然申请不是啥难事。希望大家敢想敢拼，敢于对国自然基金发出你热血沸腾的挑战！